本發明涉及一種肺癌多基因變異文庫構建方法，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：目前腫瘤的發病率和死亡率高于其他疾病，開發以非侵入式診斷策略進行腫瘤基因診斷研發，針對腫瘤靶標與化療用藥后復發、轉移與抗藥性，而傳統疾病診斷通過臨床經驗、病理監測、細胞檢測作為依據，有靈敏度的限制，也無法做到早期發現早期治療或提早預測提早預防。新一代高通量基因檢測技術，當今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的IonTorrentTM系列測序儀為代表，有著其他技術不可比擬的高通量、低成本等優勢。已被廣泛用于各類生物學研究核醫學檢測。對有參考的物種序列，進行全基因組重測序，在全基因組水平上檢測突變位點，發現個體差異的分子基礎。新一代測序技術通過全基因組測序構建了大量常規物種的基因組圖譜，也促進了測序技術的告訴發展。同時，高通量測序技術在基因診斷和基因治療方面也有著重要的作用，某些疾病的易感基因通常只占基因組很小的一部分，對這些易感基因的研究并不需要對全基因組測序，而只需要對特定的幾個基因進行研究，目標序列捕獲測序的出現，使得對基因組塔頂區域的研究成為可能。這項技術首先合成大量能與基因組特定區域互補結合的寡核苷酸序列，通過PCR擴增富集目標區段，然后用高通量測序技術對這些區段進行測序。SNPs(單核苷酸多態性)指在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數核苷酸序列一直，而只有一個堿基不同的現象。SNP是人類DNA中常見的變異形式，數以百萬存在整個人類的基因組中，部分SNP能夠導致蛋白質氨基酸編碼改變或基因表達調控改變。拷貝數變異(CNV，Copynumbervariations)指在人類基因組中廣泛存在的，從1Kbp到數百萬bp范圍內的缺失、插入、重復和復雜多位點的變異。SNPs和CNVs是人類表型變異的兩個重要潛在來源，都是與基因組參考序列比對，與基因表達形狀各有不同程度的顯著相關。對SNPs的關聯研究目前較多，許多CNVs位于基因結構變異的復雜區域，一些CNVs與鄰近的SNPs存在連鎖不平衡，可通過檢驗SNPs基因型推測鄰近的CNVs。理想的是每個樣本DNA能用一個整合的分析同時檢測SNPs和CNVs，擴增子測序能根據研究者目的，針對目標區域進行高覆蓋度的測序，還可以檢測到低頻突變。采用擴增子測序，研究者可以對基因組中感興趣的關鍵區域進行重點研究。肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤，肺癌的發病率在多數國家呈明顯上升趨勢,且逐年不斷增高,是世界各地最常見癌的一種,其發病率及死亡率占各種惡性腫瘤的首位。因此研究和發現與肺癌發生、發展相關的因子對于肺癌的早期發現、早期診斷及治療方案的擬定和預后的判斷具有重要的意義。目前，對于肺癌基因檢測的診斷方法多數停留在單個基因或者幾個位點的檢測水平，檢測方法多為熒光PCR、芯片法等，但這種方法存在不同的缺陷，如操作復雜，引物或探針設計復雜、結果不易判讀、重復性差、假陽性和假陰性多，檢測靈敏度低、聯合基因數目較少、通量低等，不能滿足臨床多樣本多位點篩查、診斷和檢測的實際需求，從而使腫瘤患者錯失了最佳的治療時期。而且多重PCR擴增效率的一致性一直是大難題。擴增子越多，不均一性越高。這使用大于500Kb的范圍的測序，很難用擴增子測序的方法做好。利用深度測序檢測CNV是近年來快速發展的新領域，CNV檢測的分辨率和準確率隨著測序深度的增加而提高。與芯片技術相比較，在足夠測序深度的條件下，可以獲得更加準確的CNV端點位置。并且，通過深度測序技術，可以檢測基因芯片所不能檢測的倒位和插入等基因組變異形式，由于深度測序技術無需設計探針，能在全基因組范圍內以單個堿基的分辨率檢測CNV，因而可以顯著提高CNV的檢出個數。為獲得能滿足文庫擴增所需要的模板次級文庫，經消化后的擴增產物需要聚丙烯酰氨凝膠電泳或瓊脂糖凝膠純化，去除未消化的核酸、消化后的碎片、核酸酶等，可見目前常見的次級文庫制備方法存在產量低或者特異性差的缺陷。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是提供一種測序通量高，靈敏度強，特異性強，基于二代測序平臺技術，能夠用于檢測游離DNA低頻突變的肺癌多基因變異文庫構建方法。本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種肺癌多基因變異文庫構建方法，包括以下步驟：A.根據肺癌相關基因的變異區域，設計能夠檢測這些變異區域的引物對；B.通過引物設計軟件得到各引物對的參數W1、Tm1、W2和Tm2，從而計算得到各引物對的判斷參數R，計算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；其中，W1是擴增產物的GC含量，Tm1是擴增產物的退火溫度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火溫度和下游引物退火溫度的平均值，將判斷參數R的值小于或等于1的引物對，歸為第一組引物組合液，將判斷參數R的值大于1的引物對，歸為第二組引物組合液；C.將待測樣品DNA抽提純化；D.分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品進行初始PCR擴增得到目標片段，然后清除引物，采用第一組引物組合液進行初始PCR擴增時的退火溫度低于采用第二組引物組合液進行初始PCR擴增時的退火溫度；E.對所述目標片段進行接頭連接得到帶接頭片段，然后進行純化；F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液對純化后的帶接頭片段進行文庫PCR擴增，然后進行純化，得到測序文庫。上述肺癌相關基因包括AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、C-met、DDR2、ERBB3、FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11，TSC1、TSC2，EGFR、TP53、PTEN、FGFR1中的一種或多種；其中AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、C-met、DDR2、ERBB3、FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11，TSC1、TSC2的變異測序類型是突變測序，EGFR、TP53、PTEN的變異測序類型是外顯子測序；C-met、HER2、FGFR1、PIK3CA的變異測序類型是擴增測序。上述引物對所覆蓋的變異區域包括chr1：162754624-162754667、chr1：162754761-162754855、chr1：162759815-162759873、chr1：162775671-162775740、chr1：162778592-162778698、chr14:104770390-104770420、chr14:104772927-104772980、chr14:104773502-104773537、chr14:104773920-104773953、chr14:104775128-104775143、chr14:104776719-104776747、chr14:104780114-104780142、chr14:104792600-92637、chr2:29193886-29193891、chr2:29196820-29196858、chr2:29197575-29197633、chr2:29214035-29214042、chr2:29223520-29223528、chr2:29225500-29225518、chr2:29226922-29226934、chr2:29296963-29296968、chr2:29318371-29318380、chr2:29328373-29328388、chr2:29333767-29333795、chr2:29694861-29694888、chr2:29920019-29920086、chr7:140734607-140734688、chr7:140753301-140753370、chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr9：21971186-21971208、chr9：21974764-21974803、chr9：21968234-21968234、chr12：56085007-56085128、chr12：56086541-56086555、chr12：56087577-56087640、chr12：56096505-56096539、chr12：56097153-56097184、chr12：56101967-56102051、chr10：121479871-121479899、chr10：121483723-121483769、chr10：121503794-121503854、chr10：121538612-121538640、chr10：121551339-121551363、chr10：121564503-121564565、chr10：121593750-121593777、chr5：177089639-17789673、chr5：177093269-177093311、chr5：177096144-177096163、chr5：177097296-177097324、chr12：25227304-25227374、chr12：25245285-25245312、chr15：66387410-66387421、chr15：66443280-66443310、chr15：66490556-66490572、chr1：11117046-11117073、chr1：11130582-11130597、chr1：11109657-11109693、chr1：11258571-11258588、chr1：114716116-11471652、chr2:177230956-177230973、chr2:177231581-177231624、chr2:177231869-177231911、chr9:95446922-95446944、chr9:95453505-95453539、chr9:95459693-95459726、chr9:95469086-95469107、chr9:95508250-95508271、chr10:43100510-43100560、chr10:43111228-43111238、chr10:43111342-43111412、chr10:43121969-43121991、chr7:129189158-129189225、chr7:129210436-129210486、chr7:129212139-129212169、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr9:132896605-132896654、chr9:132902616-132902673、chr9:132904419-132904449、chr9:132905730-132905803、chr9:132906751-132906779、chr9:132928836-132928863、chr16:2048689-2048723、chr16:2050409-2050486、chr16:2061964-2062005、chr16:2070478-2070523、chr16:2071878-2071911、chr16:2084534-2084653、chr16:2086217-2086296、chr3:179198915-179198966、chr3:179199803-179199860、chr3:179203618-179203697、chr3:179204553-179204586、chr3:179210214-179210276、chr17:39707104-39707141、chr17:39710358-39710389、chr17:39715774-39715862、chr17:39724825-39724865、chr17:39726571-39726598、chr17:39727871-39727981、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、chr7:116775003-116775102、chr8:38413973-38414170、chr8:38415881-38415915、chr8:38417348-38417370、chr8:38429801-38429814、chr8:38457373-38457422、chr7:55173921-55174039、chr7:55174726-55174810、chr7:55181301-55181337、chr7:55181365-55181457、chr7:55191729-55191869、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048中的一個或多個。上述步驟F中的混合液是第一組引物組合液和第二組引物組合液按照體積比為1﹕1混合而成。上述引物對的5’端均引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。上述步驟D中初始PCR擴增時，在反應體系中加入二甲基亞砜，加入二甲基亞砜的體積占反應體系體積的3％～7％。上述步驟F中文庫PCR擴增時，在反應體系中加入甘油，加入甘油的體積占反應體系體積的5％～8％。上述步驟E中帶接頭片段的純化是采用磁珠進行純化，所述步驟F中文庫PCR擴增產物的純化是采用磁珠進行純化。上述步驟D中第一組引物混合液在初始PCR擴增時的實驗條件是：99℃，2min，1個循環；99℃，15s，55℃，20s，72℃，30s15個循環；上述步驟D中第二組引物組合液在初始PCR擴增時的實驗條件是：99℃，2min，1個循環；99℃，15s，65℃，20s，72℃，30s，15個循環；上述步驟F中第一組引物組合液和第一組引物組合液的混合液在文庫擴增的實驗條件是：98℃，2min，1個循環；99℃，15s，62℃，1min，5個循環。本發明具有積極的效果：(1)本發明提供一種基于二代測序平臺技術的肺癌多基因文庫構建方法，能夠實現樣本濃度低起始量(低于10ng)、高通量、短周期、低成本的建庫。采用本發明的文庫構建方法所得到的文庫進行測序，可以一次檢測27個基因的上百個突變位點和4基因的拷貝數變異，相對于一代測序突變的成本節約5000元/樣本。該文庫能夠同時檢測SNPs和CNVs等基因變異，通過對測序結果分析可以對肺癌患者進行預后評估。(2)本發明中所用的引物組合物是針對肺癌相關基因突變位點的特定序列進行設計，通過5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基，使得各引物之間相互干擾性小。通過分管擴增捕獲所選取變異區域，相互之間幾乎不干擾。根據判斷參數R將引物組合物分管進行擴增，在其他條件相同的條件下，文庫構建的成功率由原來的70％提高到93％。本發明可以用于微量DNA文庫構建，降低對檢測樣本的要求，樣本的DNA濃度可以低至1ng～10ng，與其他建庫相比，文庫起始量降低了40ng。(3)本發明計算的基因突變、基因拷貝數變異與金標準實驗結果對比，二代測序的敏感度和特異度分別是98.6％和99.2％；(4)本發明對樣本的DNA濃度要求很低，所以可以適用于游離循環腫瘤DNA(針對肺癌病人的外周血DNA，ctDNA)，省去組織穿刺(biopsy)的腫瘤細胞純度不足、采樣不便、不確定風險與傳統方法難測到基因突變的感度、覆蓋度問題；具有方便采樣、可早期檢測與復發評估、易定期追蹤、高靈敏度、高精準分辨率及專一性的優勢。(5)本發明對初始擴增和文庫擴增過程中使用的試劑進行優化，建立最適合建庫的反應條件，與現有的實驗步驟相比，本發明在文庫初始擴增和文庫擴增，引入一定少量的有機試劑，初始擴增時采用二甲基亞砜、文庫擴增時采用甘油，通過在反應步驟中加入有機試劑，文庫構建的成功率由原來的93％提高到97％。具體實施方式下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術人員可以根據上述本
發明內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。主要試劑：所有試劑購買自正規廠家：MultisourceGenomicDNAMiniprepKit(Axygen)、肺癌多基因檢測引物第一組引物組合液和第二組引物組合液(上海百力格生物技術有限公司)、5*IonAmpliSeqTMHiFiMix(Lifetechnologies)、FuPaReagentTM(Lifetechnologies)、AmPureXPReagent磁珠(Lifetechnologies)、IonPGMBeads(Lifetechnologies)、PGMTemplateOT2Solutions(Lifetechnologies)、PlatinumPCRSuperMixHighFidelity(Lifetechnologies)、LibraryAmplificationPrimerMix(Lifetechnologies)等。上機模板準備和上機過程中用到的試劑和耗材與IonTorrent二代測序平臺相配套，包括PGMTemplateOT2kit和Ion314chip等部分。本方法實驗前需要新鮮配制的試劑：75％乙醇(100％乙醇與無核酸酶水按3:1比例配制)。主要儀器：IonTorrentPGM測序儀、3.0熒光定量儀、高速離心機、水浴鍋、漩渦震蕩儀、冰箱、滅菌鍋、磁力架、移液槍、PCR儀、震蕩儀等。本實施例的肺癌多基因變異文庫構建方法，包括以下步驟：A.根據肺癌相關基因的變異區域，設計能夠檢測這些變異區域的引物對；B.根據引物和產物的GC含量、Tm值，將引物對分成兩組，即第一組引物組合液和第二組引物組合液；C.將待測樣品DNA抽提純化；D.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品分別進行初始PCR擴增，得到目標片段，然后清除引物；E.對所述目標片段進行接頭連接得到帶接頭片段，然后采用磁珠進行純化；F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液對純化后的帶接頭片段進行文庫PCR擴增，然后采用磁珠進行純化，得到測序文庫。整個過程中，也可以在任何步驟按照要求通過切膠回收或磁珠片段選擇的方法對DNA片段分子大小進行選擇，最終獲得所需大小DNA片段的文庫分子，并且在接頭連接中引入特征性序列標簽，用于測序中不同文庫的區分。與陰性樣品，質控品一起進行大規模平行測序，儀器獲得的結果經數據處理和生物信息學分析，得出樣本中含有的SNP位點信息。所述陰性樣本為正常人基因組DNA，所述的質控品為加入1％的controlparticles,是一種商品化試劑，包含在上機測序的試劑盒PGMSequencingOT2kit中，作為上機測序實驗的內參，對測序情況進行評估和質控，如果測序結果中不包含1％的controlparticles結果，說明上機實驗失敗，結果不可靠。一、引物設計。根據肺癌相關基因的變異區域，設計能夠檢測這些變異區域的引物對。本發明中，肺癌相關基因包括但不限于下列基因：表1肺癌多基因信息表序號基因名稱DNALocusmRNALocus測序類型1AKT1NG_012188.1NM_001014431突變測序2ALKNG_009445.1NM_004304突變測序3BRAFNG_007873.3NM_004333突變測序4BRCA1NG_005905.2NM_007294突變測序5BRCA2NG_012772.3NM_000059突變測序6CDKN2ANG_007485.1NM_000077突變測序7DDR2NG_016290.1NM_001014796突變測序8ERBB3NG_011529.1NM_001005915突變測序9FGFR2NG_012449.2NM_000141突變測序10FGFR4NG_012067.1NM_001291980突變測序11KRASNG_007524.1NM_004985.4突變測序12MAP2K1NG_008305.1NM_002755突變測序13mTORNG_033239.1NM_004958突變測序14NRASNG_007572.1NM_002524突變測序15NRF2NC_000002.1NM_001145412突變測序16PTCH1NG_007664.1NM_000264突變測序17RETNG_007489.1NM_020630突變測序18SMONG_023340.1NM_005631突變測序19STK11NG_007460.2NM_000455突變測序20TSC1NG_012386.1NM_000368突變測序21TSC2NG_005895.1NM_000548突變測序22PIK3CANG_012113.2NM_006218突變、擴增測序23HER2NG_007503.1NM_001005862突變、擴增測序24C-metNG_008996.1NM_000245突變、擴增測序25FGFR1NG_007729.1NM_001174063擴增測序26EGFRNG_007726.3NM_005228外顯子測序27TP53NG_017013.2NM_000546外顯子測序28PTENNG_007466.2NM_000314外顯子測序本實施例根據上述各肺癌相關基因的變異區域，設計用于檢測這些肺癌相關基因的變異區域是否存在變異的引物對。變異區域包括各基因的外顯子區域，或者與外顯子相連的上下游30bp的內含子區域，或者與肺癌相關的其他突變區域。引物對能夠覆蓋表1中所有基因的需要檢測的變異區域。所覆蓋的區域如下：chr1：162754624-162754667、chr1：162754761-162754855、chr1：162759815-162759873、chr1：162775671-162775740、chr1：162778592-162778698、chr14:104770390-104770420、chr14:104772927-104772980、chr14:104773502-104773537、chr14:104773920-104773953、chr14:104775128-104775143、chr14:104776719-104776747、chr14:104780114-104780142、chr14:104792600-92637、chr2:29193886-29193891、chr2:29196820-29196858、chr2:29197575-29197633、chr2:29214035-29214042、chr2:29223520-29223528、chr2:29225500-29225518、chr2:29226922-29226934、chr2:29296963-29296968、chr2:29318371-29318380、chr2:29328373-29328388、chr2:29333767-29333795、chr2:29694861-29694888、chr2:29920019-29920086、chr7:140734607-140734688、chr7:140753301-140753370、chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr9：21971186-21971208、chr9：21974764-21974803、chr9：21968234-21968234、chr12：56085007-56085128、chr12：56086541-56086555、chr12：56087577-56087640、chr12：56096505-56096539、chr12：56097153-56097184、chr12：56101967-56102051、chr10：121479871-121479899、chr10：121483723-121483769、chr10：121503794-121503854、chr10：121538612-121538640、chr10：121551339-121551363、chr10：121564503-121564565、chr10：121593750-121593777、chr5：177089639-17789673、chr5：177093269-177093311、chr5：177096144-177096163、chr5：177097296-177097324、chr12：25227304-25227374、chr12：25245285-25245312、chr15：66387410-66387421、chr15：66443280-66443310、chr15：66490556-66490572、chr1：11117046-11117073、chr1：11130582-11130597、chr1：11109657-11109693、chr1：11258571-11258588、chr1：114716116-11471652、chr2:177230956-177230973、chr2:177231581-177231624、chr2:177231869-177231911、chr9:95446922-95446944、chr9:95453505-95453539、chr9:95459693-95459726、chr9:95469086-95469107、chr9:95508250-95508271、chr10:43100510-43100560、chr10:43111228-43111238、chr10:43111342-43111412、chr10:43121969-43121991、chr7:129189158-129189225、chr7:129210436-129210486、chr7:129212139-129212169、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr9:132896605-132896654、chr9:132902616-132902673、chr9:132904419-132904449、chr9:132905730-132905803、chr9:132906751-132906779、chr9:132928836-132928863、chr16:2048689-2048723、chr16:2050409-2050486、chr16:2061964-2062005、chr16:2070478-2070523、chr16:2071878-2071911、chr16:2084534-2084653、chr16:2086217-2086296、chr3:179198915-179198966、chr3:179199803-179199860、chr3:179203618-179203697、chr3:179204553-179204586、chr3:179210214-179210276、chr17:39707104-39707141、chr17:39710358-39710389、chr17:39715774-39715862、chr17:39724825-39724865、chr17:39726571-39726598、chr17:39727871-39727981、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、chr7:116775003-116775102、chr8:38413973-38414170、chr8:38415881-38415915、chr8:38417348-38417370、chr8:38429801-38429814、chr8:38457373-38457422、chr7:55173921-55174039、chr7:55174726-55174810、chr7:55181301-55181337、chr7:55181365-55181457、chr7:55191729-55191869、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048。本實施例中的引物對的設計和制備采用現有的常規方法。本實施例中的引物對包括特異性上游引物和特異性下游引物，上游引物和下游引物是根據所覆蓋的變異區域在參考基因組的起始和終止位置設計的。引物均由母液稀釋而成，母液由百力格生物技術有限公司合成的干粉稀釋而成，引物的最終濃度為100nM。引物純度應達到PAGE或者HPLC級，不含雜帶。設計時所用核苷酸序列均來自NCBI數據庫公布的基因序列，引物擴增后的產物長度主要集中在100bp-500bp之間。引物的核苷酸序列可為任意的已知序列，其序列自身不形成發卡二級結構，且G、C含量占堿基數量總和的30％～70％，引物序列選擇長度18bp～25bp的核苷酸序列。使用專門的多重引物設計軟件包(如DNAsoftwares的VisualOMP,MultiPLX，ABI的PrimerExpress等)來設計引物，為了減少在核酸擴增過程中假象例如引物二聚體的形成，引物對經過預測在擴增過程中顯示最小的與引物中其他引物的相互作用、各個引物對的Tm等參數盡量接近、不要存在嚴重的二級結構比如發夾、dimers等。通過使用不同的軟件，綜合評價，將引物盡可能設計為靶特異性或者擴增子特異性的，并且引物通常被分組為子集以使引物間相互作用、引物二聚體形成和超級擴增子減少至最低程度。PCR的延伸是從引物3’端開始的，并決定著PCR產物的特異性，而5’端則限定PCR產物的長度。5’端修飾后不但不影響正常的PCR反應，而且修飾后的引物能夠更穩定地與模板結合，對于PCR產物的分析與進一步操作有很大的方便，在引物上進行基團修飾，引物所攜帶的修飾基團隔離開其他引物，使得同一反應體系中，完成更多引物的同時擴增。引物5’端修飾包括磷酸化修飾、氨基修飾和引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基，優選地為5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。本實施例中設計的引物對是經過反復實驗篩選驗證得到的最佳組合引物對，能夠實現高效、快速、微量建庫，保持了與現有建庫方法的文庫測序流程的兼容性，靈活方便，可以用于IonProton測序平臺，適于構建IonProton的文庫，構建文庫可以直接上機測序。本實施例中的引物對可以直接應用到不同的第二代測序平臺，包括但不限于由Illumina，LifeTechnologies(ABI)，Roche，HelicosBiotechnologies，PacificBiosciences這些公司制造的儀器，同樣也適用于其它廠商生產的測序儀。二、引物對分組。由于擴增的模板是固定的序列模板，設計引物時不可避免會有GC含量和Tm值不一致的引物對，為了順利構建測序文庫，這些差別較大的引物對在實驗的過程中對實驗條件和樣本的要求會更加嚴格，并且實驗結果不一定立項。退火溫度是引物和模板結合時候的溫度參數，即當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度，它是影響PCR特異性的較重要因素，為了確定較適合的退火溫度，根據引物和產物的GC含量、退火溫度等相關參數計算的判斷參數R，從而更加方便準確地將設計合成、稀釋后引物分成兩組。判斷參數R的計算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]。其中，W1是擴增產物的GC含量，Tm1是擴增產物的退火溫度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火溫度和下游引物退火溫度的平均值。W1、W2、Tm1、Tm2是設計引物核苷酸序列時，通過多重引物設計軟件包，自動生成的參數。通過軟件包生成的參數代入，計算公式得到所有引物對的判斷參數R(R一般保留5位有效數字)，其中判斷參數R的值小于或等于1的引物對，歸為第一組引物混合液，判斷參數R的值大于1的引物對，歸為第二組引物混合液。以基因DDR2為例，在NCBI數據庫中找到該基因的DNA序列(NG_016290)，找到DNA序列中檢測覆蓋區域：chr1：162754624-162754667、chr1：162754761-162754855、chr1：162759815-162759873、chr1：162775671-162775736、chr1：162778592-162778698；根據軟件PrimerExpress設計覆蓋目的區域的引物對，引物對盡可能設計為靶特異性并且與其他引物不相互干擾，設計后的引物核苷酸序列如表2所示。表2DDR2引物序列表表2中的引物由百力格生物技術有限公司合成，合成引物的5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。根據判斷參數R的取值，序號為1、2、4的引物對歸為第一組引物組合液；序號為3和5的引物對歸為第二組引物組合液。其他肺癌相關基因的引物設計和分組參照DDR2基因，最終將設計檢測肺癌相關基因變異區域的所有引物對分組，引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基的引物對分別合成稀釋后，按照分組的結果配置成第一組引物對組合液和第二組引物組合液。第一組引物對組合液和第二組引物組合液在初始擴增分別進行初始擴增反應，能夠增加每個反應擴增產物的總體產物率，然后在引物清除步驟再將擴增產物等量混合在一起進行實驗。三、待測樣品DNA抽提純化。本實施例中檢測5例肺癌患者的組織樣本和5例正常組織樣本，這10例樣本的相關位點已經經過ARMS驗證。本發明中的檢測樣本為能提取核酸的任意形式的腫瘤樣品，較佳地為組織樣本，包括但不限于：全血、血清、血漿和組織樣品；組織樣品包括但不限于：石蠟包埋組織、新鮮組織和冰凍切片。3.1樣本DNA抽提采用試劑盒(AxygenMultisourceGenomicDNAMiniprepKit)提取肺癌患者組織樣本的DNA，具體的操作參見試劑盒產品說明書。抽提結束后用Thermo-Fisher核酸蛋白定量儀(NanoDrop2000)測定樣本濃度。3.2DNA純化1)取5ngDNA，加入Nuclease-freeWater至40μL；2)加入1.5倍體積(60μL)Ampurebeads，室溫放置5min，再放置于磁力架上約5min，至澄清；3)棄上清，用75％的酒精(200μL，現配現用)洗滌2次，晾干(不要過干)；4)用25μLNuclease-freeWater溶解，Qubit檢測濃度。3.3組織樣本DNA濃度測定采用3.0對抽提后的DNA濃度測定：1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內吸棄1ul工作液，加入1ul的DNA樣本，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:1ul，此時顯示的結果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個樣本：取出Qubit3.0熒光光度計中樣本。四、獲得目標片段。分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品進行初始PCR擴增得到目標片段，然后清除引物。4.1初始PCR擴增由于初始PCR擴增是多重PCR反應，每一個引物對在擴增反應中與另外的引物競爭有限量的dNTPs、聚合酶和其他試劑，因此存在對改進的方法和組合物需要，以允許選擇性擴增一群核酸分子內的多個靶核酸分子，同時避免非特異性擴增產物和引物二聚體的形成，或者將非特異性擴增產物和引物二聚體的程度降至最低，達到更高效、低濃度檢測。本發明在反應體系中加入有機試劑，有機試劑包括甘油、橄欖油、DMSO(二甲基亞砜)，優選地，在初始擴增加入的有機試劑為DMSO(二甲基亞砜)。采用本實施例的第一組引物組合液和第二組引物組合液，若樣本的濃度大于10ng，可以將第一組引物組合液和第二組引物組合液混合在一起對樣本進行初始PCR擴增。若樣本的濃度小于10ng，必須分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液進行初始PCR擴增，以保證文庫的質量，下面以樣本的濃度小于10ng為例。按照表3中的初始PCR擴增反應體系，進行試劑配比。表3初始PCR擴增反應體系成分反應體系分為兩管，一管反應體系采用第一組引物組合液，另一管反應體系采用第二組引物組合液，其他成分相同。在反應體系中加入少量的二甲基亞砜(DMSO)，能夠降低熔解溫度，有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結構區，提高引物特異性，有效促進GC含量高達52％～73％模板的擴增，使用低濃度的引物，少量循環，使得引物間互不干擾。分兩管分別進行初始PCR擴增反應得到目標片段(目標區域測序目的片段)，采用第一組引物組合液的擴增反應程序如表4所示，采用第二組引物組合液的擴增反應程序如表5所示。表4采用第一組引物組合液的擴增反應程序表5采用第二組引物組合液的擴增反應程序PCR反應條件：特異引物與靶序列退火延伸，選擇較高的復性溫度以減少引物和模板間的非特異性結合,確保PCR反應的特異性。復性時間略微延長,以使引物與模板之間完全結合，但是延伸時間不宜過長,否則會導致非特異性擴增帶的出現。4.2引物清除在兩管擴增反應分別獲得目標片段后，不同的擴增目標區域產物再混合在同一個反應體系中，進行文庫構建步驟，降低了樣品檢測的要求，提高測序反應的效率。將兩管初始PCR擴增的產物等體積混合成一管，取20ul的PCR產物混合物，加入2ulFuPaReagent，此時總體積為22μL，漩渦充分混勻，瞬間離心2秒，根據表6的程序清除引物。表6引物清除反應程序PCR產物可立即使用或保存于-20℃冰箱。五、獲得接頭片段。對目標片段進行接頭連接得到帶接頭片段，然后采用磁珠進行純化。5.1接頭反應拿出SwitchSolution，室溫混勻，將清除引物后的目標片段置于樣品管中，漩渦充分混勻，瞬間離心2秒,取2ul加入如表7所示的接頭反應體系中。表7接頭反應體系成分表將上述反應體系放入PCR儀內，進行引物清除，反應程序如表8所示。表8接頭反應程序表Barcode為合成的單鏈，其中所述隨機序列有6～12個堿基隨機組成且位于靠近單鏈游離DNA3’端的一側，所述Adaptor序列為任意的已知序列且位于遠離單鏈游離DNA3’端的一側，兩種試劑均由LifeTechnologies提供。通過連接反應，獲得各連接唯一標簽序列的核酸樣本，樣品可立即使用或保存于-20℃冰箱。5.2純化，采用AmpureXPReagent磁珠：1)向樣品管中加入45μL(1.5倍樣品體積)AmpureXPReagent，混勻，室溫孵育5min；2)將樣品管放在磁力架上，靜置2min，至管內溶液完全澄清；3)棄上清，保持離心管在磁力架上，溫和添加150μL70％酒精(現配現用)洗滌beads(輕輕旋轉樣品管，充分洗滌)；4)重復上述步驟，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要過干)。5.3測定樣本庫的濃度1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內吸棄3ul工作液，加入3ul的DNA樣品，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:3ul，此時顯示的結果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個樣品：取出Qubit3.0熒光光度計中樣品，放入新的樣品，按“ReadNextSsmple”；8)重復樣本讀數，直到所有樣品讀完。六、文庫擴增和純化6.1文庫擴增由于文庫構建是多重PCR反應，每一個引物對在擴增反應中與另外的引物競爭有限量的dNTPs、聚合酶和其他試劑，因此存在對改進的方法和組合物需要，以允許選擇性擴增一群核酸分子內的多個靶核酸分子，同時避免非特異性擴增產物和引物二聚體的形成，或者將非特異性擴增產物和引物二聚體的程度降至最低，達到更高效、低濃度檢測。本發明在反應體系中加入有機試劑，有機試劑包括甘油、橄欖油、DMSO(二甲基亞砜)，優選地，在文庫擴增加入的有機試劑為甘油。向純化后風干的樣品中加入50μLPlatinumPCRSuperMixHighFidelity(黑色蓋)、3.5ul甘油和2ul的第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液,重懸磁珠混勻，磁力架上放置3min，取上清至PCR管中，漩渦混勻進行PCR擴增，擴增反應程序如表9所示。表9文庫擴增反應程序表甘油能夠提高文庫產量，有利于擴增后上機測序，擴增后的PCR產物可立即使用或保存于-20℃冰箱。6.2文庫純化文庫進行磁珠純化，采用AMPureXPReagent磁珠：1)將PCR產物轉移至1.5ml離心管內，加入25ul(0.5倍樣品體積)AMPureXPReagent充分吹打混勻，室溫孵育5min；2)將樣本放置磁力架上，等待5min至管內溶液完全澄清；4)小心吸取上清液并轉移到新的1.5ml離心管內；5)向上述步驟的離心管中加入60ul(1.2倍原始樣品體積)的AMPureXPReagent磁珠，吹打混勻，室溫孵育5min；6)將樣本管放在磁力架上靜止3min或至溶液澄清，棄上清；7)保持離心管在磁力架上，溫和添加150ul新鮮配制的75％酒精溶液洗滌beads(輕輕轉動樣品管，充分洗滌)，旋轉離心管，小心去除酒精；8)重復上述步驟清洗一次，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要過干)，室溫風干磁珠5min，不要過度干燥；9)將樣品管從磁力架上取下，加入50μLLowTE溶液到樣本管內，漩渦混勻；10)將樣本管放置在磁力架上，靜止2min，將洗脫的上清液轉移到新的離心管內，用Qubit檢測樣品濃度；6.3用3.0測定樣本庫的濃度1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內吸棄3ul工作液，加入3ul的DNA樣品，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:3ul，此時顯示的結果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個樣品：取出Qubit3.0熒光光度計中樣品，放入新的樣品，按“ReadNextSample”；8)重復樣本讀數，直到所有樣品讀完；純化后的文庫可直接通過IonTorrent平臺進行上機測序，測序結束以后，對獲得的測序數據進行分析，通過比對設計的引物和位點信息，篩選出肺癌相關基因上的基因突變和變異。本發明的檢測結果與臨床ARMS法檢測結果一致，測序反應樣本的數量分布均勻。本發明對肺癌多基因變異具有檢測通量高、特異性強、不易污染、安全性高的優點，檢測結果具有較好的準確性和重復性，對肺癌患者的臨床治療提供輔助診斷和提示作用。根據收集的樣本檢測情況，按照陰性樣本的結果去除的SNP位點，5例肺癌患者在10個基因上共檢測出11個熱點SNP位點，而正常組織樣本未檢測出所述熱點SNP位點。本發明實施方式中，所述的基因變異存在于肺癌但不僅限于如表1列出的肺癌相關基因，也存在常見胃癌、肝癌、乳腺癌、腸癌、食管癌等相關基因。此外應理解，在閱讀了本發明的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本發明所限定的范圍。發明人經深入研究和篩選得到一組可以用于IonProton的文庫，構建的文庫可以直接可以上機測序。多基因的變異包括突變、拷貝數變異和倒位中的至少兩種，能夠全面對肺癌患者的治療和預后做出指南。為了降低對組織樣本濃度和質量的要求，提高測序文庫構建的成功率，本發明進行了以下嘗試1)采用1ng、3ng、5ng、7ng、9ng的組織抽提DNA樣本，根據常用的退火溫度55℃進行初始濃度擴增，對文庫擴增使用60℃退火溫度，測得文庫的濃度均低于0.5ng/ul。對初始擴增和文庫擴增的退火溫度進行50℃～65℃的梯度實驗，文庫的成功率仍然很低；2)根據軟件設計引物參數對引物對進行分組，分組以50％為界，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值小于等于50％為第一組引物組合物，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值大于50％為第二組引物組合物，第一組引物組合物采用的50℃退火溫度進行初始濃度擴增，文庫擴增使用60℃退火溫度，第二組引物組合物采用的60℃退火溫度進行初始濃度擴增，文庫擴增使用60℃退火溫度，相對于初始擴增不分管擴增，文庫的成功率雖然有所提高，但是低于50％；3)退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素，良好的退火溫度，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA比引物復雜，退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成，還有模板序列組成和長度。本發明綜合考慮了引物和產物的GC含量和退火溫度參數對PCR反應的影響，設計了分管判斷參數R，根據判斷參數R對引物對分組，在初始擴增和文庫擴增的退火溫度進行50℃～65℃的梯度試驗，選擇文庫成功率較高的退火溫度，最終優選第一組引物組合液初始擴增的退火溫度為55℃，第二組引物組合液初始擴增的退火溫度為65℃，第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液在文庫擴增的退火溫度為62℃，文庫構建成功率大幅度提升，特別適用于文庫起始量低至1ng～10ng的情況。上述實施例僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明創造構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3