1.一種肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟:
A.根據(jù)肺癌相關(guān)基因的變異區(qū)域,設(shè)計(jì)能夠檢測這些變異區(qū)域的引物對;
B.通過引物設(shè)計(jì)軟件得到各引物對的參數(shù)W1、Tm1、W2和Tm2,從而計(jì)算得到各引物對的判斷參數(shù)R,計(jì)算公式如下:
R=0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)];
其中,W1是擴(kuò)增產(chǎn)物的GC含量,Tm1是擴(kuò)增產(chǎn)物的退火溫度,W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值,Tm2是上游引物退火溫度和下游引物退火溫度的平均值,
將判斷參數(shù)R的值小于或等于1的引物對,歸為第一組引物組合液,將判斷參數(shù)R的值大于1的引物對,歸為第二組引物組合液;
C.將待測樣品DNA抽提純化;
D.分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對純化后的樣品進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增得到目標(biāo)片段,然后清除引物,采用第一組引物組合液進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增時的退火溫度低于采用第二組引物組合液進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增時的退火溫度;
E.對所述目標(biāo)片段進(jìn)行接頭連接得到帶接頭片段,然后進(jìn)行純化;
F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液對純化后的帶接頭片段進(jìn)行文庫PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行純化,得到測序文庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于:所述肺癌相關(guān)基因包括AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、C-met、DDR2、ERBB3、 FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11,TSC1、TSC2,EGFR、TP53、PTEN、FGFR1中的一種或多種;其中AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、 C-met、DDR2、ERBB3、FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11,TSC1、TSC2的變異測序類型是突變測序,EGFR、TP53、PTEN的變異測序類型是外顯子測序;C-met、HER2、FGFR1、PIK3CA的變異測序類型是擴(kuò)增測序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于:所述引物對所覆蓋的變異區(qū)域包括chr1:162754624-162754667、chr1:162754761-162754855、chr1:162759815-162759873、chr1:162775671-162775740、chr1:162778592-162778698、chr14:104770390-104770420、chr14:104772927-104772980、chr14:104773502-104773537、chr14:104773920-104773953、chr14:104775128-104775143、chr14:104776719-104776747、chr14:104780114-104780142、chr14:104792600-92637、chr2:29193886-29193891、chr2:29196820-29196858、chr2:29197575-29197633、chr2:29214035-29214042、chr2:29223520-29223528、chr2:29225500-29225518、chr2:29226922-29226934、chr2:29296963-29296968、chr2:29318371-29318380、chr2:29328373-29328388、chr2:29333767-29333795、chr2:29694861-29694888、chr2:29920019-29920086、chr7:140734607-140734688、chr7:140753301-140753370、chr17:43082440-43082543、chr17:43092005-43092100、chr17:43092907-43092953、chr17:43093990-43094074、chr17:43106475-43106492、chr17:43115753-43115774、chr13:32326505-32326575、chr13:32332322-32332386、chr13:32332536-32332638、chr13:32333139-32333219、chr13:32336459-32336562、chr13:32337435-32337471、chr13:32363206-32363316、chr13:32398684-32398766、chr9:21971186-21971208、chr9:21974764-21974803、chr9:21968234-21968234、chr12:56085007-56085128、chr12:56086541-56086555、chr12:56087577-56087640、chr12:56096505-56096539、chr12:56097153-56097184、chr12:56101967-56102051、chr10:121479871-121479899、chr10:121483723-121483769、chr10:121503794-121503854、chr10:121538612-121538640、chr10:121551339-121551363、chr10:121564503-121564565、chr10:121593750-121593777、chr5:177089639-17789673、chr5:177093269-177093311、chr5:177096144-177096163、chr5:177097296-177097324、chr12:25227304-25227374、chr12:25245285-25245312、chr15:66387410-66387421、chr15:66443280-66443310、chr15:66490556-66490572、chr1:11117046-11117073、chr1:11130582-11130597、chr1:11109657-11109693、chr1:11258571-11258588、chr1:114716116-11471652、chr2:177230956-177230973、chr2:177231581-177231624、chr2:177231869-177231911、chr9:95446922-95446944、chr9:95453505-95453539、chr9:95459693-95459726、chr9:95469086-95469107、chr9:95508250-95508271、chr10:43100510-43100560、chr10:43111228-43111238、chr10:43111342-43111412、chr10:43121969-43121991、chr7:129189158-129189225、chr7:129210436-129210486、chr7:129212139-129212169、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr9:132896605-132896654、chr9:132902616-132902673、chr9:132904419-132904449、chr9:132905730-132905803、chr9:132906751-132906779、chr9:132928836-132928863、chr16:2048689-2048723、chr16:2050409-2050486、chr16:2061964-2062005、chr16:2070478-2070523、chr16:2071878-2071911、chr16:2084534-2084653、chr16:2086217-2086296、chr3:179198915-179198966、chr3:179199803-179199860、chr3:179203618-179203697、chr3:179204553-179204586、chr3:179210214-179210276、chr17:39707104-39707141、chr17:39710358-39710389、chr17:39715774-39715862、chr17:39724825-39724865、chr17:39726571-39726598、chr17:39727871-39727981、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、chr7:116775003-116775102、chr8:38413973-38414170、chr8:38415881-38415915、chr8:38417348-38417370、chr8:38429801-38429814、chr8:38457373-38457422、chr7:55173921-55174039、chr7:55174726-55174810、chr7:55181301-55181337、chr7:55181365-55181457、chr7:55191729-55191869、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048中的一個或多個。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟F中的混合液是第一組引物組合液和第二組引物組合液按照體積比為1﹕1混合而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于:所述引物對的5’端均引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟D中初始PCR擴(kuò)增時,在反應(yīng)體系中加入二甲基亞砜,加入二甲基亞砜的體積占反應(yīng)體系體積的3%~7%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟F中文庫PCR擴(kuò)增時,在反應(yīng)體系中加入甘油,加入甘油的體積占反應(yīng)體系體積的5%~8%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟D中第一組引物混合液在初始PCR擴(kuò)增時的實(shí)驗(yàn)條件是:99℃,2min,1個循環(huán);99℃,15s,55℃,20s,72℃,30s 15個循環(huán);
所述步驟D中第二組引物組合液在初始PCR擴(kuò)增時的實(shí)驗(yàn)條件是:99℃,2min,1個循環(huán);99℃,15s,65℃,20s,72℃,30s,15個循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟F中第一組引物組合液和第一組引物組合液的混合液在文庫擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)條件是:98℃,2min,1個循環(huán);99℃,15s,62℃,1min,5個循環(huán)。
10.一種采用如權(quán)利要求1所述的肺癌多基因變異文庫構(gòu)建方法所構(gòu)建的測序文庫。