本發明涉及一種藥物組生物及其制備方法和應用，特別是涉及一種以氨基酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物及其制備方法和應用。

背景技術：

近來有文獻報道聚乙二醇（PEG）修飾的方法可以用于中藥難溶性有效成分前藥的合成。PEG作為一種無毒、生物相容性好、無感染和非抗原性的藥物載體，常結合水不溶或水溶性低的分子發揮其增溶的作用。氨基酸具有良好的生物相容性和親和性，且廉價易得，在醫藥領域發揮著舉足輕重的作用，部分抗腫瘤藥物經氨基酸修飾后增加了對腫瘤細胞的靶向性，抗腫瘤活性有明顯提高，對機體正常細胞的毒性作用也有所降低。

齊墩果酸（Oleanolic Acid，OA，Fig1）作為五環三萜類化合物的典型代表，具有顯著的抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等藥理活性。但齊墩果酸的水溶性非常差，限制了其臨床應用。為增加其溶解性及生物利用度，將PEG修飾的方法引進齊墩果酸前藥的合成中，使用了一系列不同相對分子質量的PEG通過不同氨基酸作為連接臂合成了齊墩果酸衍生物。通過對齊墩果酸的結構改造，提高水溶性和延長體內半衰期，提高其生物活性，有望開發具有良好應用前景的藥物。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種，。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種以氨基酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物，其結構通式為：

其中，X=Y=-CH₂或X=H，Y=0，R表示-H，-CH₃，-CH(CH₃)₂，-CH₂CH(CH₃)₂，-CHCH₃(CH₂CH₃)，-CH₂C₆H₅，-(CH₂)₂-S-CH₃；mPEG選用mPEG₁₀₀₀，mPEG₂₀₀₀，mPEG₅₀₀₀，mPEG₆₀₀₀，mPEG₈₀₀₀，mPEG₁₀₀₀₀，mPEG₂₀₀₀₀。

一種以氨基酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物制備方法，所述衍生物由以下步驟制備：

（1）將mPEG溶于無水丙酮中，室溫攪拌下滴加三乙胺，將溶于無水丙酮中的對甲苯磺酰氯，滴加至上述溶液中，0-40℃下攪拌反應；反應結束后，抽濾除去三乙胺鹽酸鹽沉淀；濾液濃縮后逐滴加入至冷卻無水乙醚中，析出固體，無水乙醇重結晶，得白色固體mPEG-OTs；

（2）將mPEG-OTs溶解于DMF中，加入氨基酸的鈉鹽或鉀鹽，于40-90℃下攪拌反應；反應結束后，過濾除去不溶物，攪拌下將濾液逐滴加入至冷卻無水乙醚中，過濾收集沉淀，乙醚清洗，真空干燥。將固體溶于蒸餾水中，用鹽酸調pH 至3，CH₂Cl₂萃取3次，合并萃取液，水洗，無水Na₂SO₄干燥過夜，過濾后溶液減壓蒸至原體積的十分之一，滴加到冷卻無水乙醚中，得白色沉淀，真空干燥，得白色固體mPEG-氨基酸衍生物；

（3）將mPEG-氨基酸和齊墩果酸溶于干燥的二氯甲烷中，冰水浴中攪拌，加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）和N，N-二環己基碳二亞胺（DCC），室溫反應；反應完畢后過濾，水洗有機相，無水Na₂SO₄干燥，過濾，濃縮并用無水乙醚沉淀，抽濾，真空干燥，得到目標化合物。

以氨基酸作為連接臂的聚乙二醇齊墩果酸衍生物的應用，所述齊墩果酸衍生物的藥物組合物具有抗腫瘤活性，用于治療腫瘤疾病。

本發明的優點與效果是：

本發明提供的mPEG-AA-OA復合物的水溶性與原藥齊墩果酸對比，至少提高了1000倍，可見PEG化具有明顯的增溶效果。

本發明提供的mPEG-AA-OA復合物通過體外抑制超氧陰離子和1,1-二苯基-2-間三硝基苯肼（DPPH）的活性測試。結果表明，此類化合物具有良好的抗氧化活性。

本發明提供的mPEG-AA-OA復合物采用MTT法進行初步的體外抗腫瘤活性測試。研究結果表明，所合成的部分化合物對多種腫瘤細胞株具有明顯的抑制作用，結果優于齊墩果酸。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明進行詳細說明。

實施例1：mPEG₅₀₀₀-OTs的制備

將5. 0 g mPEG₅₀₀₀溶于50mL無水丙酮中，室溫攪拌下滴加三乙胺2mL( 14. 4mmol) ，將溶于5 mL無水丙酮中的對甲苯磺酰氯2g ( 6. 4mmol)滴加至上述溶液中，室溫反應過夜。反應結束后過濾除去三乙胺鹽酸鹽沉淀。將濾液濃縮至原溶液的十分之一后逐滴加入至冷卻無水乙醚200 mL中，析出固體，過濾收集沉淀，真空干燥，無水乙醇重結晶，得白色固體mPEG₅₀₀₀-OTs ( 4. 24 g，85%) 。

同法可制得其他分子量mPEG₅₀₀₀-OTs化合物。

實施例2：mPEG₅₀₀₀-Pro的制備

取mPEG₅₀₀₀-OTs 2. 0 g 溶解于DMF 20 mL 中，加入脯氨酸的鉀鹽0. 38 g（2mmol），回流反應12 h。反應結束后過濾除去不溶物，攪拌下將濾液逐滴加入至冷卻無水乙醚200 mL 中，過濾收集沉淀，乙醚清洗3 次，真空干燥，再溶于蒸餾水50 mL 中，5mol /L鹽酸調pH 至3，CH₂Cl₂萃取（10mL×3），合并萃取液，水洗，再用無水Na₂SO₄干燥過夜，過濾后溶液減壓蒸至原溶液的十分之一后，滴加到冷卻無水乙醚100 mL 中，得白色沉淀，真空干燥，得白色固體（1. 15 g，58. 0%）；mp:56. 5～60. 5℃；IR（KBr，ν）: 3450，2890，1734，1465，1285，1118，850cm^-1。

同法可制得不同的mPEG-氨基酸復合物。

實施例3：mPEG₅₀₀₀-Pro-OA的制備

將mPEG₅₀₀₀-Pro 0. 4 g和齊墩果酸0. 053 g（0. 117 mmol）溶于干燥的二氯甲烷20 mL中，冰水浴中攪拌，加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）20 mg 和N，N-二環己基碳二亞胺（DCC）30 mg，室溫反應24 h。反應完畢后過濾，水洗有機相兩次，無水Na₂SO₄干燥，過濾，濃縮并用無水乙醚沉淀，收集后真空干燥，得到白色固體物mPEG-Pro-OA（0. 38 g，75%）。mp：56. 5～59. 6℃；IR（KBr，ν）:3384，1732，1640，1400，1106 cm^-1。¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 5.39 (1H,t, J = 3.4 Hz, H-12), 4.48 (1H,dd, J = 10.0, 5.9 Hz, H-3), 2.56 (1H,dd, J = 12.8, 3.3 Hz, H-18), 2.05 (3H,s,3-COCH₃), 1.16(3H,s,-CH₃), 0.93(3H,s,-CH₃), 0.91(6H,s,2CH₃), 0.87(3H,s,-CH₃), 0.85(3H,s,-CH₃), 0.78(3H,s,-CH₃), 3. 64(446H,m,-OCH₂CH₂-,mPEG-backbone), 6.95( 1H,d,NH).

同法可制得不同分子量聚乙二醇及多種氨基酸作為連接臂的mPEG-AA-OA化合物。

實施例4：對本發明制備的mPEG-AA-OA化合物進行溶解度測試。

分別將過量的齊墩果酸，mPEG-AA-OA化合物加入到10mL的水中，將這些混懸液置于25^oC恒溫振蕩器內振搖24h，停止振搖后放置2h，達到平衡后，取上清液用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液，適當稀釋后用高效液相色譜法測定濃度并計算它們在水中的溶解度。齊墩果酸和部分mPEG-AA-OA結合物的溶解度列于表1中。如表1所示mPEG-AA-OA結合物可以顯著提高齊墩果酸在水中的溶解度，溶解度隨著mPEG分子量的增大而減少，但均高于齊墩果酸。

實施例5：對本發明制備的mPEG-AA-OA化合物分別進行了抗腫瘤活性測試。

采用MTT法對齊墩果酸及所合成衍生物進行初步的體外抗腫瘤活性測試。部分mPEG-AA-OA衍生物對HepG2細胞體外細胞毒試驗結果如表1所示。研究結果表明，所合成的部分化合物對HepG2腫瘤細胞株具有明顯的抑制作用，結果優于齊墩果酸。

表1 mPEG-AA-OA化合物溶解性及HepG2細胞毒活性

^a化合物濃度在10^-5mol/L時測得的抑制率。