本發明屬于固相萃取技術領域，特別涉及一種苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱的制備方法及使用方法，并和高效液相色譜方法結合用于選擇性分離、富集及檢測藥品中的核苷類物質的含量。

背景技術：

分子印跡技術是指采用人工方法制備在空間結構和結合位點上對特定分子有專一性結合作用的聚合物技術。分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers,mips)是通過模板分子、功能單體和交聯劑三者之間相互作用而合成的一種具有三維空間結構的“受體”，對模板分子具有獨特的“記憶”功能，因而表現出特殊的親和性、高度的選擇性以及卓越的分子識別能力。盡管如此，分子印跡聚合物在其制備過程中仍存在印跡位點分布不均一、“包埋”過深，不利洗脫等問題，為了解決這些問題，一些新型的分子印跡材料相繼發展起來。

中空分子印跡(hollowmolecularlyimprintedpolymers,h-mips)技術作為一種新型分子印跡技術，是在表面分子印跡技術的基礎上，通過化學溶解或刻蝕的方法，去除載體基質，得到具有中空結構的聚合物，這種新型制備技術制得的聚合物使大部分結合位點分布在載體基質材料表面上，有利于模板分子的洗脫和目標物的再結合，有效的解決了在分子印跡技術發展過程中出現的印跡位點分布不均一、“包埋”過深，不利洗脫等問題，同時又減小了聚合物內部存在擴散阻力，提高印跡材料吸附分離效率，因而被廣泛應用于固相萃取等方面。

硼酸化學法是利用硼酸基團在堿性水溶液中可以與順式二醇類物質，如核苷類物質所含的順式鄰位或間位羥基發生可逆反應形成環狀二酯，并且在酸性條件下實現可逆地解離，從而對含有順式二醇結構的核苷進行分離富集。這種ph開關的特性使硼酸成為優良的親和識別配基。利用硼酸對順式二醇結構的特異性識別，制備硼酸修飾的h-mips，可以實現對核苷類物質的選擇性識別及分離富集。并且，利用苯硼酸和核苷中順式二醇結構的可逆作用，可以增強材料對特定核苷的選擇性。同時，可以利用ph值控制吸附/解吸過程。

苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱制備過程中的粒徑、分散性、比表面積及吸附效果的優化是使核苷類物質能有效地被材料富集并與基體溶液快速方便地分離的前提條件。另外，在移除mcm-48基質后，要在聚合物的表面形成一個單孔，從而制得中空分子印跡聚合物，要求中空分子印跡聚合物的大部分吸附位點都位于聚合物的內外表面上，這一特點有利于提高聚合物的質量轉移速率同時也將提高聚合物的吸附容量。因此，上述合成條件的控制是本專利擬解決的關鍵技術問題。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種苯硼酸修飾的中空分子印跡聚合物，包含該聚合物的固相萃取柱的制備和使用方法，與高效液相色譜檢測方法結合，可實現對藥品中含有順式二醇結構的核苷類物質(胞苷、鳥苷、尿苷及肌苷)含量的同時檢測。

具體的，本發明提供的苯硼酸修飾的中空分子印跡聚合物的制備方法，包括如下步驟：

s1：以3-氨基苯硼酸為修飾劑，對甲基丙烯酸單體進行化學修飾，使得甲基丙烯酸表面修飾有對核苷具有硼親和作用的苯硼酸結構，所述甲基丙烯酸單體和3-氨基苯硼酸的物質的量比1：1～3；

具體反應過程如式(1)所示；

s2：以介孔分子篩mcm-48為基質，具有順式二醇結構的尿苷為模板，s1制得的表面修飾有苯硼酸結構的甲基丙烯酸作為功能單體，加入交聯劑和引發劑制備分子印跡材料，對制得的分子印跡材料進行洗脫模板，并采用氫氟酸腐蝕掉基質介孔分子篩mcm-48，制得中空分子印跡聚合物；

其中，模板、功能單體、交聯劑、引發劑的物質的量之比為：2.5～4：10：40～100：0.6～5，每1g基質中添加的功能單體為1.5～5mmol。

具體反應過程如式(2)所示；

優選地，所述介孔分子篩mcm-48是以正硅酸乙酯為硅源，以十六烷基三甲基溴化胺為活性劑，采用水熱合成法合成得到的；

具體反應過程如式(3)所示；

優選地，所述交聯劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯，所述引發劑為偶氮二異丁腈。

優選地，s1的具體過程為：將甲基丙烯酸單體與3-氨基苯硼酸按照物質的量比為1:1～3的比例混合，溶解于乙腈中，室溫下攪拌12～18h，得到表面修飾有苯硼酸結構的甲基丙烯酸。

更優選地，s2的具體過程為：向表面修飾有苯硼酸結構的甲基丙烯酸中加入模板尿苷，靜置4～6h；依次加入交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯和引發劑偶氮二異丁腈，使模板、功能單體、交聯劑和引發劑的物質的量之比為：2.5～4：10：40～100：0.6～5，通n210～30min，40～80℃下攪拌1～2h；之后，向體系中加入介孔分子篩mcm-48，超聲15～30min，通n2密封，在40～70℃下攪拌2h，65～80℃下攪拌18～20h，80～100℃下攪拌6～8h，制得聚合物微球；

將制備得到的聚合物微球抽濾乙醇洗滌后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蝕10h，過濾洗滌后，將聚合物微球置于索式提取器中，用甲醇/乙酸混合溶劑洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印跡聚合物；

所述甲醇/乙酸混合溶劑中甲醇與乙酸的體積比為10-x：x，x選自1～3之間的任意數值。

優選地，本發明還提供了一種苯硼酸修飾的中空分子印跡聚合物，具體由上述任一所述的制備方法制得。

優選地，本發明還提供了一種苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱，包括中空固相萃取柱，所述中空固相萃取柱內填充有填充層，所述填充層的底部和頂部均安裝有篩板；所述填充層所填材料為上述苯硼酸修飾的中空分子印跡聚合物。

更優選地，本發明還提供了該苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱與高效液相色譜檢測方法結合，在藥品中檢測含有順式二醇結構的核苷類物質含量的應用。

更優選地，所述核苷類物質為胞苷、鳥苷、尿苷或肌苷。

更優選地，苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱與高效液相色譜檢測方法結合，檢測藥品中含有順式二醇結構的核苷類物質含量的具體步驟如下：

將所述苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，依次用溶劑甲醇和水在負壓狀態下活化小柱，之后抽干溶劑，備用；

將待檢測的樣品溶液在負壓狀態下連續通過所述苯硼酸修飾的中空分子印跡固相萃取柱，抽干樣品溶液；

用正已烷做淋洗劑在負壓狀態下連續通過固相萃取柱進行淋洗，抽干淋洗劑，并保持連續抽干狀態；

采用1～5％三氟乙酸/乙腈混合溶劑做洗脫劑在負壓狀態下連續通過固相萃取柱對分析物進行洗脫，抽干洗脫劑，所述1～5％三氟乙酸/乙腈混合溶劑中，1～5％三氟乙酸和乙腈的體積比為10-y：y，y選自1～5之間的任意數值；

將洗脫液過濾后進入高效液相色譜儀進行檢測，測定藥品中含有順式二醇結構的核苷類物質含量。

本發明提供的硼親和中空分子印跡固相萃取柱對核苷類物質具有明顯的富集效果，主要是由于分子印跡對模板分子及結構類似物的選擇性吸附、并且中空分子印跡的大部分結合位點分布在載體基質材料表面及中空腔內，提高了吸附效率，此外，硼酸基團對含有順式二醇結構的核苷類物質能實現可逆的吸附和解離。這種ph開關的特性使硼酸成為優良的親和識別配體。以上三種效果的共同作用，使得固相萃取柱具有明顯的吸附效果。

附圖說明

圖1為本發明實施例1提供的載體基質mcm-48及制備得到的硼親和的中空分子印跡聚合物的掃描電鏡圖。

具體實施方式

為了使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案能予以實施，下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。

需要說明的是，以下實施例中所用到的試劑若無特別說明，均為常規試劑，可在市場上購買得到，所涉及的相關化合物的制備方法或檢測方法，若無特別說明，均為常規方法。

實施例1

一種硼親和中空分子印跡固相萃取柱的制備

分別稱取1.00mmol的單體甲基丙烯酸和1.00mmol的3-氨基苯硼酸，將二者混合均勻，之后溶解于40ml乙腈中，室溫下攪拌12h，得到甲基丙烯酸表面修飾有對核苷具有硼親和作用的苯硼酸結構；

向上述苯硼酸結構中加入模板尿苷，添加量為0.25mmol，0℃下靜置4h；加入5.00mmol的交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引發劑偶氮二異丁腈0.457mmol，通n210min，40℃下攪拌1h；之后，向體系中加入200mg的介孔分子篩mcm-48，超聲15min，通n2密封，在40℃下攪拌2h，65℃下攪拌18h，80℃下攪拌6h，制得聚合物微球；

將上述制備得到的聚合物微球抽濾乙醇洗滌后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蝕6h，過濾洗滌后，將聚合物微球置于索式提取器中，用體積比為9:1的甲醇/乙酸混合溶劑洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印跡聚合物，該中空分子印跡聚合物的掃描電鏡圖如圖1所示；

稱取200mg上述中空分子印跡聚合物材料，填充至5ml底部裝有篩板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置篩板并壓實，完成。

上述制備得到的硼親和中空分子印跡固相萃取柱的應用

以銀杏達莫注射液作為實際樣品，進行實際樣品的富集和凈化，具體的步驟為，精密量取實際樣品2ml，置50ml容量瓶中，加流動相稀釋至50ml刻度，搖勻，取適量溶液至具塞離心管中，于4000r·min^-1條件下離心10min后，過濾，取濾液，并將此濾液作為實際樣品上樣溶液；

將硼親和的中空分子印跡固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，依次用3ml甲醇，3ml水在負壓狀態下活化，并抽干活化溶劑；

將上述實際樣品上樣溶液2ml在負壓狀態下連續通過固相萃取柱，使實際樣品中的核苷類成分在固相萃取柱中被吸附，抽干上樣溶液；再以3ml正已烷做淋洗劑在負壓狀態下連續通過固相萃取柱進行淋洗，抽干淋洗劑，并保持連續抽干狀態；以0.5ml體積比為7:3的5％三氟乙酸/乙腈的混合溶劑作為洗脫劑，在負壓狀態下連續通過固相萃取柱對分析物進行洗脫，抽干洗脫劑；將洗脫液過濾后進高效液相色譜檢測。

對比例1

一種硼親和中空非分子印跡固相萃取柱的制備，其制備方法和實施例1相同，不同之處僅在于，在反應的過程中不加入模板分子尿苷。

對比例2

以銀杏達莫注射液作為實際樣品，直接采用高效液相色譜對藥品中的核苷類物質進行檢測，其具體分析方法和實施例1相同。

對比例3

以銀杏達莫注射液作為實際樣品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18結合高效液相色譜對藥品中的核苷類物質進行檢測，其具體分析方法和實施例1相同。

實施例2

一種硼親和中空分子印跡固相萃取柱的制備

分別稱取1.00mmol的單體甲基丙烯酸和2.00mmol的3-氨基苯硼酸，將二者混合均勻，之后溶解于50ml乙腈中，室溫下攪拌16h，得到甲基丙烯酸表面修飾有對核苷具有硼親和作用的苯硼酸結構；

向上述苯硼酸結構中加入模板尿苷，添加量為0.4mmol，20℃下靜置4h；加入4mmol的交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引發劑偶氮二異丁腈0.061mmol，通n220min，60℃下攪拌2h；之后，向體系中加入400mg的介孔分子篩mcm-48，超聲20min，通n2密封，在60℃下攪拌3h，80℃下攪拌20h，100℃下攪拌6h，制得聚合物微球；

將上述制備得到的聚合物微球抽濾乙醇洗滌后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蝕10h，過濾洗滌后，將聚合物微球置于索式提取器中，用體積比為8:2的甲醇/乙酸混合溶劑洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印跡聚合物；

稱取200mg上述中空分子印跡聚合物材料，填充至5ml底部裝有篩板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置篩板并壓實。

上述制備得到的硼親和中空分子印跡固相萃取柱的應用

以香丹注射液作為實際樣品，進行實際樣品的富集和凈化，具體的步驟為，精密量取實際樣品5ml，置50ml容量瓶中，加流動相稀釋至50ml刻度，搖勻，取適量溶液至具塞離心管中，于4000r·min^-1條件下離心20min后，過濾，取濾液，并將此濾液作為實際樣品上樣溶液；

將硼親和的中空分子印跡固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，依次用3ml乙腈，3ml水在負壓狀態下活化，并抽干活化溶劑；

將上述上樣溶液在負壓狀態下連續通過固相萃取柱，使實際樣品中的核苷類成分在固相萃取柱中被吸附，抽干上樣溶液；再以5ml丙酮做淋洗劑在負壓狀態下連續通過固相萃取柱進行淋洗，抽干淋洗劑，并保持連續抽干狀態；以1.0ml體積比為6:4的2％三氟乙酸/乙腈的混合溶劑作為洗脫劑，在負壓狀態下連續通過固相萃取柱對分析物進行洗脫，抽干洗脫劑；將洗脫液過濾后進高效液相檢測。

對比例4

一種硼親和中空非分子印跡固相萃取柱的制備，其制備方法和實施例2相同，不同之處僅在于，在反應的過程中不加入模板分子尿苷。

對比例5

以香丹注射液作為實際樣品，直接采用高效液相色譜對藥品中的核苷類物質進行檢測，其具體分析方法和實施例2相同。

對比例6

以香丹注射液作為實際樣品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18結合高效液相色譜對藥品中的核苷類物質進行檢測，其具體分析方法和實施例2相同。

實施例3

一種硼親和中空分子印跡固相萃取柱的制備

分別稱取1.00mmol的單體甲基丙烯酸和3.00mmol的3-氨基苯硼酸，將二者混合均勻，之后溶解于60ml乙腈中，室溫下攪拌18h，得到甲基丙烯酸表面修飾有對核苷具有硼親和作用的苯硼酸結構；

向上述苯硼酸結構中加入模板尿苷，添加量為0.25mmol，30℃下靜置6h；加入10mmol交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯，再加入引發劑偶氮二異丁腈0.12mmol，通n230min，80℃下攪拌1h；之后，向體系中加入600mg的介孔分子篩mcm-48，超聲30min，通n2密封，在70℃下攪拌4h，80℃下攪拌20h，90℃下攪拌8h，制得聚合物微球；

將上述制備得到的聚合物微球抽濾乙醇洗滌后，用含有hf的乙醇溶液浸泡刻蝕10h，過濾洗滌后，將聚合物微球置于索式提取器中，用體積比為7:3的甲醇/乙酸混合溶劑洗去模板分子后，放入真空干燥器中干燥至恒重，得到中空分子印跡聚合物；

稱取200mg上述中空分子印跡聚合物材料，填充至5ml底部裝有篩板的中空固相萃取柱中，再在填料的上方放置篩板并壓實。

上述制備得到的硼親和中空分子印跡固相萃取柱的應用

以紅花口服液作為實際樣品，進行實際樣品的富集和凈化，具體的步驟為，精密量取實際樣品2ml，置50ml容量瓶中，加流動相稀釋至50ml刻度，搖勻，取適量溶液至具塞離心管中，于4000r·min^-1條件下離心30min后，過濾，取濾液；

將硼親和的中空分子印跡固相萃取柱置于真空固相萃取裝置上，依次用5ml乙腈，5ml水在負壓狀態下活化，并抽干活化溶劑；

將上述濾液在負壓狀態下連續通過固相萃取柱，抽干溶劑；再以1ml正丁烷做淋洗劑在負壓狀態下連續通過固相萃取柱進行淋洗，抽干淋洗劑，并保持連續抽干狀態；以1.0ml體積比為5:5的1％三氟乙酸/乙腈的混合溶劑作為洗脫劑，在負壓狀態下連續通過固相萃取柱對分析物進行洗脫，抽干洗脫劑；將洗脫液過濾后進高效液相檢測。

對比例7

一種硼親和中空非分子印跡固相萃取柱的制備，其制備方法和實施例3相同，不同之處僅在于，在反應的過程中不加入模板分子尿苷。

對比例8

以紅花口服液作為實際樣品，直接采用高效液相色譜對藥品中的核苷類物質進行檢測，其具體分析方法和實施例3相同。

對比例9

以紅花口服液作為實際樣品，直接采用商品化的固相萃取柱uf-c18結合高效液相色譜對藥品中的核苷類物質進行檢測，其具體分析方法和實施例3相同。

上述實施例1-3所得的檢測溶液，以及對比例1-9的檢測溶液的液相檢測條件均為：色譜柱：diamonsilc18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：水-甲醇(v:v＝90∶10)；流速：0.9ml·min^-1；檢測波長：260nm；柱溫：30℃；進樣量：10μl。所得的液相色譜分析結果見下表1所示。

表1各實施例液相色譜分析結果

本發明實施例1-3提供的硼親和中空分子印跡固相萃取柱與對比例中空非分子印跡固相萃取柱、商品化固相萃取柱uf-c18對核苷類物質的吸附效果進行比較，結果表明，本發明提供的硼親和中空分子印跡固相萃取柱對核苷類物質具有明顯的富集效果，主要是由于分子印跡對模板分子及結構類似物的選擇性吸附、并且中空分子印跡的大部分結合位點分布在載體基質材料表面及中空腔內，提高了吸附效率，此外硼酸基團對含有順式二醇結構的核苷類物質能實現可逆的吸附和解離。這種ph開關的特性使硼酸成為優良的親和識別配體。以上三種效果共同作用，使得本發明合成的h-mips固相萃取柱具有明顯的吸附效果。

以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例，其保護范圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發明的保護范圍之內，本發明的保護范圍以權利要求書為準。