本發明涉及水稻生長發育，具體涉及一種水稻根系伸長和斑點葉性狀控制基因ospelota1及編碼的蛋白質。

背景技術：

根系作為水稻生長發育必不可少的器官,間接地決定著水稻地上部產量、品質、抗逆及廣適性等諸多農藝性狀的表現。水稻根系構型為須根系，能不斷地從莖節最靠近中柱維管的分生區細胞發生不定根，最后由數量眾多的不定根及其側根構成了它的根系結構。根型由長度、數量和空間范圍等幾個參數決定，研究發現根長決定了其他根系性狀的遺傳表現，是所有根系性狀中最重要性狀。但水稻根系因不能被人們直接收獲食用故根系性狀不被重視,人們對水稻根系性狀的認識深度與廣度遠不及對于地上部產量與品質性狀,其基礎理論與應用研究嚴重滯后。因此，重點挖掘控制水稻根長的基因，分離、克隆一系列控制根長的基因便于定向改良水稻根系性狀，如授權公告號為cn102161985的發明專利，就公開了與水稻根系生長有關的基因ksr1,該基因ksri及編碼的蛋白質有些堿基和氨基酸發生突變，水稻根系表現為短根系。

植物斑點葉突變體是指植物在沒有遭受病原物浸染或明顯逆境條件下在葉片或葉鞘上自發形成斑點的一類突變體。除少部分突變體斑點的形成可能由色素積累外，大部分是由植物本身細胞死亡引起。這類斑點葉突變體的表型多與病原菌侵染后的過敏反應癥狀類似，而且許多斑點葉突變體對某些植物病原物表現出了一定的抗性，能激發病程相關蛋白的表達,可以提高植株的持久、廣譜抗病性。因此斑點葉突變體是植物育種中一類重要的抗病種質資源，不斷挖掘和鑒定新的水稻斑點葉突變體，對水稻抗病機制研究和抗病育種實踐都有重要意義。如授權公告號為cn103937812的發明專利，就公開了水稻斑點葉性狀控制基因spl29,該基因spl29及編碼的蛋白質有些堿基和氨基酸發生突變，水稻表現為斑點葉和增強的植株抗病能力。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種水稻根系伸長和斑點葉性狀控制基因ospelota1及編碼的蛋白質，該蛋白是一個pelota蛋白，在氨基酸取代或缺失等情況下，能抑制水稻根系的伸長和導致斑點葉的發生，使水稻出現短根系，生長20天后葉片上出現棕褐色的斑點并逐漸擴散至全株。可以為水稻的根系改良和調控植株的抗病性或轉基因植物的開發創造條件。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種水稻根系伸長和斑點葉性狀控制基因ospelota1，該控制基因ospelota1的核苷酸序列如seqidno：1所示，所示的dna序列中一個或幾個堿基對錯義突變。seqidno：1序列由7945個堿基組成，自5端第172-174位為起始密碼子，包含15個外顯子和14個內含子，編碼具有序列表中seqidno：2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質，該蛋白由378個氨基酸殘基組成，為pelota蛋白，氨基酸序列中一個或幾個氨基酸錯義突變。如所示的dna序列中1802位插入一個胸腺嘧啶(t)，產生移碼突變，編碼的氨基酸序列的提前終止，只合成89個氨基酸，水稻表現出短根系和斑點葉。

該ospelota1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。

與現有技術相比，本發明的優點在于一種水稻根系伸長和斑點葉性狀控制基因ospelota1及編碼的蛋白質，該蛋白的編碼基因如序列表seqidno：1所示的堿基序列，該蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示，是一個pelota蛋白，與根系伸長和斑點葉相關；該堿基序列若發生突變，如1802位插入一個胸腺嘧啶(t)，產生移碼突變，編碼的氨基酸序列提前終止，只合成89個氨基酸，這樣該蛋白就抑制根系的伸長和導致斑點葉的發生，具體在植株表現為主根和不定根都變短，生長20天后葉片上出現棕褐色的斑點并逐漸擴散至全株。該蛋白及其編碼基因的應用，可以為水稻的根系改良和調控植株的抗病性或轉基因植物的開發創造條件。

附圖說明

圖1為野生型wt和突變體ospelota1的表型；（a）植株苗期約28天時的表型，bar=2cm。(b)60天葉齡的葉片表型，bar=1cm；

圖2為ospelota1基因的圖位克隆和基因結構。（a）ospelota1基因的分子定位，采用30個f2突變株，將ospelota1粗定位在第4號染色體的ssr分子標記rm3217和rm567之間，新發展sts多態標記sts1、sts2和sts3，將ospelota1定位在sts2和sts3之間411kb的候選區域內，該區間覆蓋4個bac克隆：osjnba0071i13、osjnba0011f23、osjnba0015k02和osjnba0084k01，ospelota1基因在bac克隆osjnba0015k02上。（b）ospelota1基因結構和突變位點，外顯子用黑色方框表示，內含子用實線表示，非翻譯區用白色框表示，箭頭指示突變位點；

圖3為60天苗齡的野生型wt、突變體ospelota1和兩株t2代轉基因回復株系（ov1和ov2）的表型。（a）根系表型，bar=4cm。（a）葉片表型，bar=1cm；

圖4為超表達轉化載體pcambia1300改的結構示意圖。

具體實施方式

以下結合附圖、實施例對本發明作進一步詳細描述。

實施例1突變體的表型及遺傳分析

從甲基磺酸乙酯誘變的秈稻（oryzasatival.sspindica）品種kasalath突變體庫中篩選到一個水稻短根系突變體ospelota1。8天苗齡的ospelota1突變體的根系伸長受到抑制，主根和不定根都變短(圖1a)，生長20天后葉片上出現棕褐色的斑點，一開始斑點出現在主葉脈或葉尖上，漸漸地斑點擴散至全株葉片及秸稈上(圖1b)。以突變體ospelota1為父本，與野生型kasalath雜交，獲得子一代f1植株與野生型kasalath完全一致，說明ospelota1為隱性突變。f1代自花授粉所得的f2中，正常植株與短根植株的分離比為147/53=2.77，卡方檢測結果為0.24<χ²0.05,1=3.84，正常植株與短根植株的比例符合一對基因控制的3：1分離比，表明該突變體是隱性單基因突變體。

實施例2ospelota1基因的定位

從突變體ospelota1和nipponbare的雜交后代f2中分離出短根突變個體，利用基因圖位克隆法（map-basedcloning）對突變基因進行定位。初定位（30個f2突變個體）將突變基因定位在第4號染色體ssr標記為rm3648和rm567之間。之后在該區間內發展了3對有多態的新的sts分子標記，分別命名為sts1，sts2和sts3，序列如下：

sts1u-5’ttgagatcaaccggctggag3’

sts1l-5’aggagcgagcgcacgtagtt3’

sts2u-5’tggatactttgtaagagcga3’

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sts3u-5’tcacgtccatcgtactatgt3’

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最終將基因鎖定在sts2和sts3之間，重組子分別為2/30和3/30，且重組的號碼不同。該區間有411kb大小（圖2a）。

實施例3基因預測和序列分析

定位區間覆蓋了4個bac克隆：osjnba0071i13、osjnba0011f23、osjnba0015k02和osjnba0084k01。從該區間內挑選出了bac克隆osjnba0015k02，根據tigr（http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/）的水稻基因注釋信息，osjnba0015k02共有22個預測的基因，將預測的基因用基因芯片分析，篩選出了4個在根系中表達水平較高的候選基因，用kasalath野生型和ospelota1突變體dna模板對候選的4個基因進行擴增，擴增產物分別測序，測序結果進行比對分析，發現基因號為loc_os04g56480（pelota）基因的dna序列的1802位插入一個胸腺嘧啶(t)（圖2b），產生移碼突變，編碼的氨基酸序列提前終止，只合成89個氨基酸。命名該基因為ospelota1。

實施例4ospelota1功能互補實驗

根據ospelota1基因的cds序列信息，設計擴增完整cds的引物，引物序列如下（加下劃線的為酶切位點）：

ospelota1-ovu：5’aaaggtaccatgaagctcgtctaccgca3’

ospelota1-ovl：5’aaactgcaggcatattgccaattctgaa3’；

采用trizol法提取水稻kasalash葉片總rna，以oligo（dt）-18為引物，以所提取的總rna為模板進行反轉錄合成第一鏈cdna。以此cdna為模板，利用primestarhsdnapolymerase擴增全長orf，pcr條件：98℃預變性10s，然后進入循環反應（98℃10s，58℃10s，72℃，1min），循環數為30，最后再延伸10min結束。瓊脂糖電泳割膠回收pcr產物，連a尾純化并連接到pmd19-t載體。連接產物熱擊轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞，37℃培養16h后挑陽性單克隆測序，測序鑒定序列無誤后用kpni和psti在37℃雙酶切過夜，連入經同樣雙酶切的pcambia1300改（35s）載體中（圖4），連接產物以相同的方法熱擊轉化大腸桿菌dh5α感受態，涂布在含有kan抗性的lb平板培養16h后挑取單克隆，搖菌抽提質粒雙酶切并通過瓊脂糖膠檢測正確后電擊轉化農桿菌eha105。

酶切檢測正確的質粒通過農桿菌株系eha105介導的水稻遺傳轉化體系導入到突變體ospelota1中，經過侵染、共培養、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉基因植株。農桿菌（eha105）介導的水稻遺傳轉化體系主要應用hiei等人(1994）報道的方法基礎上進行優化。該轉基因植株中分離的ospelota1突變體的根系和葉片都恢復成正常表型（圖3），說明ospelota1的表型確實是有ospelota1突變引起的。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。

序列表

<110>寧波大學

<120>一種水稻根系伸長和斑點葉性狀控制基因ospelota1及編碼的蛋白質

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>7945

<212>dna

<213>水稻根系伸長和斑點葉性狀控制基因ospelota1

<400>1

agattccgtgtccggtttcacatcccatcccacgctgtcgacacagcttccgccgcatcc60

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<210>2

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<213>水稻根系伸長和斑點葉性狀控制基因ospelota1編碼的蛋白質

<400>2

metlysleuvaltyrargasnleualaargasnglyproglyserval

151015

lysleuvalprogluglugluaspaspleutrphisalatyrasnleu

202530

ilevalproglyaspthrleuglnservalthrvalarglysvalleu

354045

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leugluilevalvalgluservalasptyrasplysgluglyserval

65707580

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859095

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