本發明涉及抗菌肽PaDef首次通過基因工程的方法在畢赤酵母中成功表達并且具有廣譜抑菌活性，屬于生物技術領域。

背景技術：

抗菌肽是宿主非特異性免疫防御系統產生的一類對抗外源性病原體的肽類活性物質，是天然免疫的效應分子。近些年來，隨著傳統抗生素的大量使用，耐藥細菌的出現，為人類的健康帶來了巨大的隱患。抗菌肽具有廣譜抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲的活性，且不易產生耐藥菌株的優點。目前作為抗生素的替代品或者與抗生素協同作用有望成為新的抗菌藥物。PaDef是從墨西哥鱷梨果實中分離得到，是典型的防御素類抗菌肽，與植物防御素的同源性高達80％，由45個氨基酸殘基構成，分子量為7.5KDa，包含四對二硫鍵，分子內有α螺旋和β折疊結構。在牛內皮細胞BE-E6E7中表達的PaDef可以顯著抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，但當細胞總蛋白濃度為100μg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制率僅為52-65％，對大腸桿菌的抑制率僅>55％。

目前獲取抗菌肽的方法有三種：直接提取、化學合成以及基因合成法。然而，在大多數生物體內抗菌肽的濃度非常低，直接提取耗時且成本高。化學合成法也被認為不適合大規模生產。基因工程可以使外源抗菌肽基因在原核或者真核表達系統中表達，不僅節約成本而且可以用于大規模生產。而基因工程法有可分為原核表達系統和真核表達系統，原核表達系統缺乏轉錄后加工、折疊糖基化等功能，使得有些抗菌肽在原核表達系統中無抑菌活性。另外原核表達系統表達的蛋白為融合蛋白，須超聲破碎，提高了生產成本。真核表達系統中若以細胞培養方式生產抗菌肽，需要的培養條件嚴格，儀器昂貴，而且培養基費用較高。故選擇用畢赤酵母表達系統。

畢赤酵母表達系統具有遺傳操作方便、培養基成分簡明和適合高密度發酵等優點；與原核表達系統相比，具有分泌表達和翻譯后修飾的能力，因此許多在大腸桿菌中難以表達的重組蛋白在畢赤酵母中得以成功表達。另外，該系統除了具有一般酵母所具有的特點外，還有以下幾個優點：1.含有醇氧化酶啟動子AOX1，這種啟動子嚴格受甲醇調控；2.表達量高，畢赤酵母中外源基因都帶有分泌信號肽α-factor，使外源目的蛋白分泌到培養液中，方便純化；3.發酵工藝成熟，適合高密度發酵。4.遺傳性狀穩定,不會隨著傳代而丟失。5.能進行翻譯后修飾，許多在原核表達系統中沒有抑菌活性的抗菌肽，在畢赤酵母中成功表達，是因為畢赤酵母表達系統能對外源基因進行糖基化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾功能。故選擇用畢赤酵母表達系統生產抗菌肽PaDef。

本發明以畢赤酵母為表達載體，利用甲醇進行誘導表達，首次獲得了高效表達抗菌肽PaDef的菌株，并經抑菌實驗，確定其表達產物具有廣譜抗菌活性和良好的溫度、pH和蛋白酶穩定性。這使得PaDef抗菌肽在食品、農業、醫藥上都具有巨大應用潛力。本發明技術在國內外未見公開報道或使用。

技術實現要素：

本發明的目的之一是提供一種畢赤酵母中高效制備重組PaDef抗菌肽的方法。技術方案概述如下：以畢赤酵母為宿主細胞，將抗菌肽PaDef的基因序列經過改造后(命名為mPaDef)插入到pPICZαA載體，并成功轉入畢赤酵母GS115中，利用甲醇進行誘導表達，對表達產物進行純化及活性鑒定。終產品是抗菌肽mPaDef的高表達菌株，發酵液上清中抗菌肽mPaDef產量達84mg/L。所制備重組抗菌肽具有廣譜抗菌活性兼具良好的溫度和蛋白酶穩定性，對弱酸性、中性及堿性環境的穩定性也較好。

本發明的另一目的是提供一種PaDef抗菌肽經基因改造后的新型重組抗菌肽，命名為mPaDef，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述重組抗菌肽mPaDef的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

進一步地，本發明還提供一種包含序列如SEQ ID NO:2所示的mPaDef抗菌肽的克隆載體、表達載體或宿主細胞。

更進一步地，所述克隆載體為pUC19，所述表達載體為pPICZαA，所述宿主細胞為畢赤酵母GS115。

進一步地，所述畢赤酵母高效制備重組PaDef抗菌肽的方法，具體包括如下步驟：

(1)按照SEQ ID NO：1所示合成mPaDef基因，合成后的目的基因克隆入pUC19載體上，獲得重組質粒pUC-mPaDef，采用表達載體pPICZαA以及EcoR I和Kpn I兩個限制性酶切位點，構建重組質粒pPICZαA-mPaDef；

(2)采用電轉法將經過Sac I線性化的pPICZαA-mPaDef轉入畢赤酵母GS115細胞，構建基因工程重組菌；

(3)通過PCR方法篩選轉化后長出的單克隆，得到pPICZαA-mPaDef的陽性克隆子；

(4)將pPICZαA-mPaDef陽性克隆子進行誘導表達，獲得存在于酵母發酵液上清中的重組抗菌肽。

更進一步地，誘導表達條件為，當用BMGY培養基培養pPICZαA-mPaDef陽性克隆子的OD值為8.0-10.0時，換成BMMY培養基，并用1.5％的甲醇進行誘導表達。培養基的pH值為6.0，培養溫度為28℃。

更進一步地，采用ELISA法定量發酵液上清中pPICZαA-mPaDef抗菌肽含量。1.5％甲醇誘導至144h，產量達84mg/L。

更進一步地，蛋白純化時，純化方法為一步鎳柱親和純化，分別用低濃度的20、40、60mM咪唑進行梯度漂洗去除雜蛋白，高濃度的500mM進行洗脫，純度達98％。

更進一步地，對重組抗菌肽的最小抑制濃度(MIC)進行測定，對金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)和大腸桿菌O157(ATCC 35150)的MIC為60μg/mL，對單增李斯特菌(ATCC 21633)的MIC為50μg/mL，對大腸桿菌(ATCC 10305)的MIC為30μg/mL。

更進一步地，純化產物抑菌活性鑒定。結果顯示，當受試菌為金黃色葡萄球菌時，濃度為60μg/mL的mPaDef其抑菌活性大小與50μg/mL的慶大霉素(陽性對照)無顯著區別；受試菌為單增李斯特菌時，濃度60μg/mL的mPaDef其抑菌活性大小為陽性對照的133％；受試菌為大腸桿菌O157時，濃度100μg/mL的mPaDef其抑菌活性大小為陽性對照的140％；受試菌為大腸埃希氏菌時，濃度100μg/mL的mPaDef其抑菌活性大小為陽性對照的143％。

更進一步地，純化產物穩定性研究。結果顯示，mPaDef在不同的溫度條件下穩定，能耐受的溫度范圍為4-90℃；對堿性環境、中性環境以及弱酸性環境較穩定，而對強酸性環境較敏感；對胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K的穩定性也較好。

本發明的有益效果在于：mPaDef抗菌肽作為一種新型抗菌肽，在畢赤酵母系統中成功高效表達并具有抗菌活性。發現經序列改造后的重組抗菌肽對常見致病菌具有良好的廣譜抗菌性，對致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157的最小抑菌濃度(MIC)為60μg/mL，對單增李斯特菌的MIC為50μg/mL，對大腸埃希氏菌的MIC為30μg/mL。穩定性研究結果顯示，mPaDef對溫度、蛋白酶穩定性好，對中性、堿性、弱酸性耐受性好而對強酸性耐受性較差。鑒于此，抗菌肽mPaDef在很多領域如食品、藥品、動物生產、植物抗病中顯示出巨大的應用潛力。

附圖說明

圖1為畢赤酵母高效重組表達mPaDef抗菌肽的技術路線圖。

圖2為mPaDef誘導表達結果。其中，M：小蛋白Marker，1-3分別為96、120、144h mPaDef的表達結果。

圖3為重組抗菌肽mPaDef的抑菌活性鑒定。其中，圖3(A)：對金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)的抑菌結果；圖3(B)：對單增李斯特菌(ATCC 21633)的抑菌結果；圖3(C)：對大腸桿菌O157(ATCC 35150)的抑菌結果；圖3(D)：對大腸埃希氏菌(ATCC 10305)的抑菌結果。

圖4為重組抗菌肽mPaDef的穩定性研究。其中，圖4(a)：溫度穩定性研究結果(1-5：分別經4℃、25℃、37℃、65℃、90℃條件處理1h；1′-5′：緩沖液經相同處理作為陰性對照)；圖4(b)：對pH的穩定性研究結果(1-5：用pH分別為2、4、6、8、10的緩沖液溶解至相同濃度，37℃處理4h；1′-5′：不同pH對應緩沖液作為陰性對照)；圖4(c)：對蛋白酶的穩定性研究結果(1：未經蛋白酶處理的抗菌肽作為陽性對照，1′：未加酶的緩沖液作陰性對照；2-5：分別加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶37℃處理抗菌肽2h；2′-5′：分別用各個蛋白酶所對應的緩沖液作為陰性對照)；圖4(d)、4(e)、4(f)以抑菌圈直徑(mm)的方式分別對溫度、pH、酶穩定性進行量化后的柱狀圖。

具體實施方式

下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。

實施例1：

表達載體的構建——從抗菌肽庫(http://aps.unmc.edu/AP/)和基因庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中分別獲得抗菌肽PaDef的氨基酸序列(如SEQ ID NO：4所示，APD ID:AP 02332)和基因序列(如SEQ ID NO：3所示，ACCESSION NO.KC007441)。對PaDef的基因序列進行密碼子優化和改造后，設計的基因序列如SEQ ID NO：1所示(順序為EcoR I-BamH I-ATG-6×His-GATGACGATGACAAG-PaDef-終止密碼子-XhoI-Kpn I)。然后交由蘇州金唯智生物技術有限公司進行全基因合成，插入到載體pUC19，獲得重組質粒pUC-mPaDef。用EcoR I和Kpn I分別對重組質粒pUC-mPaDef及pPICZαA空載體進行雙酶切，37℃，3h。酶切體系為10×Buffer 1μL，pUC-mPaDef/pPICZαA 1.5μg，EcoRI 0.8μL，KpnI 0.8μL，總體系10μL；回收連接，目的基因mPaDef片段和載體pPICZαA片段室溫連接2h或者4℃過夜連接，連接體系為：pPICZαA 20ng，mPaDef 8ng，T4連接酶0.8μL，總體系10μL。成功構建pPICZαA-mPaDef重組質粒。重組質粒pPICZαA-mPaDef轉化至大腸桿菌感受態細胞，進行擴增。利用限制性內切酶EcoRI和KpnI進行雙酶切驗證。驗證正確的單克隆進一步進行測序分析，以期獲得序列正確的重組質粒pPICZαA-mPaDef。

重組質粒轉入畢赤酵母GS115中——參考J.Lin et al.(2005)中的電轉方法進行。將重組質粒pPICZαA-mPaDef用SacI酶線性化酶切，酶切體系為：10×Buffer 10μL；SacI酶2μL；pPICZαA-mPaDef 1μg；ddH₂O補至總體積100μL，37℃，2h。用DNA產物純化試劑盒進行純化。將2μg線性化質粒和80μL GS115感受態細胞混合加入冰上預冷的2mm的電轉杯中。電轉參數：電壓1.5kV，電容25μF，電阻200Ω。電擊結束后迅速加入1ml預冷的1M山梨醇中，混勻后涂至含有100μg/mL Zeocin的YPDS板，28℃恒溫箱培育2-3d至單菌落長出。

重組酵母pPICZαA-mPaDef/GS115的PCR鑒定——在YPDS板上挑取20個長勢較好的克隆于30μL0.2％的SDS中，沸水浴10min，使菌體細胞膜破裂釋放出基因組DNA。12000g，4℃離心10min，取上清作為模版。PCR驗證體系為10×Buffer 2μL，MgCl₂(25mM)1.2μL，dNTPS(2.5mM)2μL，上引(5mM)0.5μL，下引(5mM)0.5μL，25％Triton X-100 0.8μL，模板1μL，DNA聚合酶0.4μL，無菌水補至總體系20μl；PCR反應條件為：95℃8min，95℃45s，57℃30s、72℃40s、72℃10min(35個循環)，16℃90min，PCR反應結束后，取5μl PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，檢測抗菌肽基因是否成功插入到畢赤酵母基因組中。

重組酵母的誘導表達——挑取PCR鑒定成功的陽性克隆于10mL BMGY培養基中，28℃220rpm培養24h，之后按5％的接種量轉接60mL(500mL三角瓶)BMGY培養基，28℃220rpm/min待OD600達到8.0-10.0時，換BMMY培養基。先3000g離心5min，棄去培養基，用無菌水洗兩次菌體，再用BMMY培養基重懸菌體，置于28℃ 220rpm/min搖床上誘導表達。每24h取一次樣，并加入過濾膜除菌的100％甲醇，使其終濃度為1.5％，連續培養144h。將誘導前和每24h取的樣品跑Tricine-SDS-PAGE蛋白電泳，檢測目的蛋白是否表達。

ELISA法定量發酵液上清中重組抗菌肽mPaDef含量——用實驗室自己制備的純度大于97％的帶有6×His標簽的苜蓿中華根瘤菌烯脂酰ACP還原酶(FABI1)蛋白作為標準蛋白，將標準蛋白用包被液分別稀釋至0、50、200、600、1000ng/ml。96孔板每孔加入200μL標準蛋白溶液，每個濃度3個重復孔，4℃溫育12～16h。洗滌緩沖液(PBST)洗三次，每孔加入200μL 0.5％PBS-BSA封閉液，37℃溫育1h，封閉非特異性結合位點。PBST洗三次，孵育一抗(his-tag 1:1000)，每孔100μL，37℃溫育1.5h。PBST洗三次，孵育二抗(HRP-Goat-anti-mouse 1:5000)，每孔100μL，37℃溫育1.5h。PBST洗三次，于各反應孔中加入TMB顯色液150μL，室溫顯色30min。然后各反應孔中加入50μL 0.5M H₂SO₄終止液，立即充分震蕩混勻。5min內在酶標儀上吸收光450nm處讀值。將系列濃度的標準溶液的相應吸光度值制作標準曲線。將發酵液上清包被在96孔板，操作如上，最終將吸光度值代入標準曲線公式，對發酵液上清中重組抗菌肽mPaDef進行定量。

重組抗菌肽mPaDef的鎳柱親和純化——將1.5％甲醇誘導、第144h酵母培養液12000g，4℃離心10min，過0.22μm濾膜。用3KDa的超濾管將酵母上清液置換到結合緩沖液(20mM磷酸鹽，300mM氯化鈉，10mM咪唑，pH 7.4)。將蛋白上清液加入Ni柱，4℃，水平搖床結合過夜。次日純化柱垂直固定于鐵架臺上，收集流穿液。分別用含有20mM、40mM、60mM咪唑的漂洗液(20mM磷酸鹽，300mM氯化鈉，pH 7.4)，進行漂洗三次，去除雜蛋白。用1mL高濃度咪唑洗脫液洗脫(20mM磷酸鹽，300mM氯化鈉，500mM咪唑，pH 7.4)，洗脫5次。最后用Tricine-SDS-PAGE及銀染法對目的蛋白進行驗證分析。結果顯示，1.5％甲醇誘導至144h，重組抗菌肽mPaDef產量達84mg/L，純度達98％。

重組抗菌肽的最小抑制濃度(MIC測定)——將純化后的mPaDef真空冷凍干燥成粉末狀，用無菌Tris-HCl(pH 7.4)溶解后，梯度稀釋到濃度分別為20、30、40、50、60、90μg/mL，分別取20μL加入96孔板的不同孔中，每個濃度三個重復，陰性對照為20μL濃度為50μg/mL的慶大霉素，陽性對照為20μL無菌Tris-HCl溶液。將OD₆₀₀為1.0-1.5的受試菌稀釋至10⁵CFU/mL，取100μL加入上述孔中。37℃搖床培養12h后用酶標儀測定OD₆₀₀，能抑制受試菌生長的最低蛋白濃度為最小抑制濃度。結果顯示，對金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)和大腸桿菌O157(ATCC 35150)的MIC為60μg/mL，對單增李斯特菌(ATCC 21633)的MIC為50μg/mL，對大腸桿菌(ATCC 10305)的MIC為30μg/mL。

重組抗菌肽mPaDef的活性鑒定——參考Fan et al.(2010)中的瓊脂擴散法進行。分別挑取受試菌單菌落于5mL的LB液體培養基中，37℃搖床培養過夜，至菌體密度約為2-7×10⁵CFU/mL。取500μL稀釋后的菌液均勻涂布于LB平板上，用直徑為6mm的金屬打孔器在平板合適的位置打孔。每孔滴加50μL的一定濃度的抗菌肽樣品。并設置陰性對照為同體積空載pPICZαA轉化的GS115培養后上清，陽性對照為慶大霉素(50μg/mL)。培養過夜后觀察并測量抑菌圈的直徑。結果顯示，當受試菌為金黃色葡萄球菌時，濃度為60μg/mL的mPaDef其抑菌圈直徑為12.2mm，與50μg/mL的慶大霉素(陽性對照)無顯著區別；受試菌為單增李斯特菌時，濃度60μg/mL的mPaDef其抑菌圈直徑為14.7mm，是陽性對照的133％；受試菌為大腸桿菌O157時，濃度100μg/mL的mPaDef其抑菌圈直徑為13.5mm，是陽性對照的140％；受試菌為大腸埃希氏菌時，濃度100μg/mL的mPaDef其抑菌圈直徑為10.2mm，是陽性對照的143％。

抗菌肽mPaDef對溫度、pH、蛋白酶穩定性研究-溫度穩定性實驗：將純化并凍干后的重組抗菌肽mPaDef粉末用10mM的磷酸鹽緩沖液溶解至60μg/mL，然后分別在4、25、37、65、90℃條件下處理1h后做抑菌圈實驗。pH穩定性實驗：分別為pH為2、4、6、8、10的不同緩沖液溶解至60μg/mL，4h后做抑菌圈實驗。蛋白酶穩定性實驗：分別加入胃蛋白酶(最適pH2.0)、木瓜蛋白酶(最適pH6.0)、蛋白酶K(最適pH7.0)、胰蛋白酶(最適pH8.0)，37℃處理抗菌肽樣品2h后做抑菌圈實驗。結果顯示，mPaDef在不同的溫度條件下穩定，能耐受的溫度范圍為4-90℃；對堿性環境、中性環境以及弱酸性環境較穩定，而對強酸性環境較敏感；對胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K的穩定性也較好。

本發明不僅首次構建了pPICZαA-mPaDef重組表達載體，提供了一種鱷梨果實來源的新型抗菌肽在畢赤酵母中成功高效表達的方法，而且表達的重組抗菌肽mPaDef具有廣譜抑菌性，對革蘭氏陽性和陰性菌均能起到很好的抑菌效應，對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157、大腸埃希氏菌這些常見致病菌能起到顯著抑制作用。且mPaDef在溫度范圍4-90℃能耐受1h活性無顯著變化；在胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K處理2h時活性無顯著變化；在弱酸性、中性及堿性環境下4h活性無顯著變化，在強酸性環境中活性有所降低。說明該體系表達的抗菌肽將在食品、衛生醫療、動物飼料等許多領域發揮巨大的應用潛力。

本文雖然已經給出了本發明的一些實施例，但是本領域的技術人員應當理解，在不脫離本發明精神的情況下，可以對本發明的實施例進行改變。上述實施例只是實例性的，不應以本文的實施例作為本發明權利范圍的限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大學

<120> 一種畢赤酵母高效表達重組PaDef抗菌肽的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gaattcggat ccatgcatca tcatcatcat cacgatgacg atgacaagtg tgaaactcca 60

tctaagcatt ttaacggttt gtgtattaga tcttctaact gtgcttctgt ttgtcatggt 120

gaacatttta ctgatggtag atgtcaaggt gttagaagaa gatgtatgtg tttgaagcca 180

tgttgactcg agggtacc 198

<210> 2

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Cys Glu Thr Pro

1 5 10 15

Ser Lys His Phe Asn Gly Leu Cys Ile Arg Ser Ser Asn Cys Ala Ser

20 25 30

Val Cys His Gly Glu His Phe Thr Asp Gly Arg Cys Gln Gly Val Arg

35 40 45

Arg Arg Cys Met Cys Leu Lys Pro Cys

50 55

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> Persea americana var. drymifolia

<400> 3

tgcgagactc ccagcaagca tttcaatggg ctgtgtataa ggagcagcaa ctgtgcatcc 60

gtctgtcatg gcgagcattt cactgatgga cggtgccaag gtgttcgtag gcgctgcatg 120

tgtctcaagc cttgc 135

<210> 4

<211> 45

<212> PRT

<213> Persea americana var. drymifolia

<400> 4

Cys Glu Thr Pro Ser Lys His Phe Asn Gly Leu Cys Ile Arg Ser Ser

1 5 10 15

Asn Cys Ala Ser Val Cys His Gly Glu His Phe Thr Asp Gly Arg Cys

20 25 30

Gln Gly Val Arg Arg Arg Cys Met Cys Leu Lys Pro Cys

35 40 45