一種多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體及其高效表達金屬硫蛋白的方法
【專利摘要】本發明提供一種多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體及其高效表達金屬硫蛋白的方法，屬于生物化學【技術領域】，該方法是構建多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體；將構建的重組表達載體轉化畢赤酵母GS115或KM71中，在不含組氨酸的培養基上篩選到重組菌；將篩選到的重組菌接種于BMGY培養液，快速振蕩培養，離心收集菌體，用培養液重懸，稀釋，快速振蕩培養至對數期加入甲醇，流加甲醇繼續培養；收集菌體，超聲破碎，離心收集上清，可從上清中分離純化到金屬硫蛋白。本發明方法克服了傳統金屬硫蛋白制備方法的不足，有效避免了大量動物資源的浪費、細菌源內毒素污染，降低了生產成本，提高了蛋白產量。
【專利說明】—種多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體及其高效表達金屬硫蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物化學【技術領域】，具體地說是一種多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體及其高效表達金屬硫蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]一般的，金屬硫蛋白(Metallothioneins,簡稱MTs)是一類富含巰基、與金屬離子具有高度親和性的低分子量蛋白。金屬硫蛋白在生物界廣泛分布，含有61個氨基酸，其中20個氨基酸為半胱氨酸，少數有21個，每個分子可結合7-12個金屬離子。由于MTs分子中富含巰基，從而使其在生物體中具有多種重要的生理功能，如重金屬的解毒、體內微量元素的平衡調節、自由基的清除等等。由于具有廣譜高效的保健效果和極高的醫療價值，可應用于包括醫藥、食品保健及化妝品添加劑、基因工程試劑、化學、環保、動物、農業等實驗用品等等，前景十分廣闊。
[0003]目前，國內主要采用兔肝或豬肝生產金屬硫蛋白。該方法首先用重金屬離子誘導豬、兔，使之產生金屬硫蛋白，然后，宰殺取其肝臟提取其中的金屬硫蛋白。然而，用該方法獲得金屬硫蛋白，設備投入大、轉讓費高、提純步驟繁瑣且產量極低(最高達8.6mg/g豬肝)，需要消耗大量動物資源。現時，已有文獻報道利用基因工程手段構建大腸桿菌工程菌生產金屬硫蛋白的方法，然而產量較低(CN1141395C)。雖然融合蛋白表達技術為金屬硫蛋白的表達提供了新方法(CNlO1144093B)，但仍存在產率低這個不足之處(最高達25.2mg/L發酵液)。因此，急需尋找一種成本低、效果好、產量高、適合大規模生產的方法。
[0004]近年來，以酵母作為工程菌表達外源蛋白日益引起重視。酵母是單細胞真核生物，不僅具有大腸桿菌易操作、繁殖快、易于工業化生產的特點，還安全，并具有真核生物表達系統基因表達調控和蛋白修飾功能，避免了產物活性低，包涵體變性、復性等等間題。其中，畢赤酵母表達系統具有遺傳穩定、背景蛋白少、易高密度發酵、外源蛋白表達量高等優點，是目前應用最為廣泛的酵母表達系統。已有300多種外源蛋白在該表達系統中獲得表達，主要用于人類藥物的生產。

【發明內容】

[0005]本發明的技術任務是解決現有技術的不足，提供一種多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體及其高效表達金屬硫蛋白的方法。
[0006]本發明的技術方案是按以下方式實現的，該多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體的獲得方法是:將按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計金屬硫蛋白的編碼序列，將所設計的金屬硫蛋白基因插入載體PA0815上的EcoRI位點后，得到含單拷貝金屬硫蛋白表達盒的表達載體，用限制性內切酶Bgl II及BamH I從得到的單拷貝表達載體上分離金屬硫蛋白表達盒，將其再次插入到單拷貝表達載體的BamH I位點，得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，重復上述插入程序構建出多拷貝表達的金屬硫蛋白表達盒數目逐漸增加的重組表達載體。
[0007]所設計的金屬硫蛋白的編碼序列是SEQ ID N0.1。
[0008]聞效表達金屬硫蛋白的方法，包括以下步驟:
(1)構建多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體:
將按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計金屬硫蛋白的編碼序列，將所設計的金屬硫蛋白基因插入載體PA0815上的EcoRI位點后，得到含單拷貝金屬硫蛋白表達盒的表達載體，用限制性內切酶Bgl II及BamH I從得到的單拷貝表達載體上分離金屬硫蛋白表達盒，將其再次插入到單拷貝表達載體的BamH I位點，得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，重復上述插入程序構建出多拷貝表達的金屬硫蛋白表達盒數目逐漸增加的重組表達載體；
(2)將(I)中構建的重組表達載體轉化畢赤酵母GS115或KM71中，在不含組氨酸的培養基上篩選到重組菌；
(3)將(2)篩選到的重組菌接種于BMGY培養液，28~30°C下快速振蕩培養16~20小時，1500~3000g離心5分鐘，收集菌體，用BMMY培養液重懸，稀釋至OD6tltol約1.0，28~30°C下快速振蕩培養至對數期加入甲醇至終濃度0.5%~1.5%，此后，每24小時向培養基中加入甲醇繼續培養96~150小時；
(4)收集菌體，超聲破碎，離心收集上清，可從上清中分離純化到金屬硫蛋白。
[0009]本發明與現有技術相比所產生的有益效果是:
1、目前，市場上已有的產品是通過誘導活體動物產生金屬硫蛋白，再從動物肝臟中提取金屬硫蛋白的方法制得。該方法生產成本高、提純步驟繁瑣且產量極低。雖然此后一些文獻報道的方法通過基因工程、蛋白工程使金屬硫蛋白產量有了一定提高，但產率仍很低(最高25.2mg/L發酵液)。本發明通過增加基因拷貝數使金屬硫蛋白獲得了高效表達，得率高，每升發酵液可得到42mg金屬硫蛋白。
[0010]2、本發明方法使用的宿主菌是酵母，具有生長迅速、繁殖快、原料價廉、便于基因操作、易于規模化等諸多優點，而且安全無毒，可用來發酵制備各種食品和藥物，在醫藥、保健食品、食品添加劑的生產上已有廣泛應用。
[0011]3、本發明方法克服了傳統金屬硫蛋白制備方法的不足，有效避免了大量動物資源的浪費、細菌源內毒素污染，降低了生產成本，提高了蛋白產量。
[0012]4、本發明方法還可通過發酵條件及發酵工藝的優化，不斷提高產量，降低生產成本。
【具體實施方式】
[0013]下面對本發明的一種多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體及其高效表達金屬硫蛋白的方法作以下詳細說明。
[0014]本發明的一種高效表達金屬硫蛋白的方法，包括以下步驟:
(1)構建多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體:
將按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計金屬硫蛋白的編碼序列，將所設計的金屬硫蛋白基因插入載體PA0815上的EcoRI位點后，得到含單拷貝金屬硫蛋白表達盒的表達載體，用限制性內切酶Bgl II及BamH I從得到的單拷貝表達載體上分離金屬硫蛋白表達盒，將其再次插入到單拷貝表達載體的BamH I位點，得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，重復上述插入程序構建出多拷貝表達的金屬硫蛋白表達盒數目逐漸增加的重組表達載體；
(2)將(1)中構建的重組表達載體轉化畢赤酵母GS115或KM71中，在不含組氨酸的培養基上篩選到重組菌；
(3)將(2)篩選到的重組菌接種于BMGY培養液，28~30°C下快速振蕩培養16~20小時，1500~3000g離心5分鐘，收集菌體，用BMMY培養液重懸，稀釋至OD6tltol約1.0, 28~30°C下快速振蕩培養至對數期加入甲醇至終濃度0.5%~1.5%，此后，每24小時向培養基中加入甲醇繼續培養96~150小時；
(4)收集菌體，超聲破碎，離心收集上清，可從上清中分離純化到金屬硫蛋白。
[0015]基因的來源可以是人類或其他動物體，針對其他動物體也可以按照這個方法去設計，提聞蛋白的表達。
[0016]實施例一:
該高效表達金屬硫蛋白的方法的步驟是:
(1)重組表達載體的構建
將金屬硫蛋白的編碼序列，按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計和合成，然后，PCR擴增金屬硫蛋白編碼序列，通過酶切、連接，將基因插入到載體PA0815上的EcoRI位點后，構建成含單拷貝金屬硫蛋白表達盒(pAOXl及金屬硫蛋白編碼序列)的表達載體；
用限制性內切酶Bgl II及BamH I從上述構建的表達載體上分離金屬硫蛋白表達盒，將其再次插入上述表達載體的BamH I位點上，得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，重復該插入程序可構建出一系列金屬硫蛋白表達盒數目逐漸增加的重組表達載體；
(2)重組菌的構建
選擇限制性內切酶線性化重組質粒DNA，之后，利用電轉化法將線性化重組質粒DNA轉入畢赤酵母GS115或KM71中，利用表達載體上His4基因與宿主的互補效應，在不含組氨酸的平板上篩選得到轉化子，必要時利用PCR技術驗證重組的發生；
(3)重組菌的培養與誘導表達
將上述重組菌接種于BMGY培養液中，28~30°C下快速振蕩培養至OD6tltol=Z~6時，1500~3000g離心5分鐘，收集菌體，用BMMY培養液重懸，稀釋至OD6tltlnm約1.0，28~30°C下快速振蕩培養至對數期加入甲醇至終濃度為0.5%-1.5%，此后，每24小時向培養基中加入甲醇至終濃度0.5%~1.5%，繼續培養96小時~150小時，離心收集菌體；
(4)金屬硫蛋白的純化
利用超聲破碎儀破碎上述收集到的菌體，離心收集上清，并通過分子篩-離子交換層析-分子篩-反向高效液相層析純化金屬硫蛋白，純度高達98%，SDS-PAGE檢測呈單一條帶狀態。
[0017]實施例二:
該種高效表達金屬硫蛋白的方法的優化步驟是:
(1)重組表達載體的構建
首先，將金屬硫蛋白編碼序列，按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計和合成，然后，PCR擴增金屬硫蛋白編碼序列，通過酶切、連接，將基因插入到載體PA0815上的EcoRI位點后，轉化感受態大腸桿菌ToplOF’,在含50ug/ul Amp的LB平板上篩選Amp抗性克隆,挑取Amp抗性轉化子，接種在含50ug/ul Amp的培養基，37°C振蕩培養過夜，提取質粒DNA ；
以上述質粒DNA為模板，5’ AOXl及3’ AOXl為測序引物進行測序驗證目的基因的正確插入；
用限制性內切酶Bgl II及BamH I從上述構建的表達載體上分離出金屬硫蛋白表達盒(pAOXl及金屬硫蛋白編碼序列)，將其再次插入上述表達載體的BamH I位點上，轉化感受態大腸桿菌ToplOF’，篩選Amp抗性克隆，提取其質粒得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，利用同樣的方法重復該過程得到三個金屬硫蛋白表達盒串聯的重組表達載體；
(2)重組菌的構建
選擇限制性內切酶Sac I線性化上述含三個表達盒的表達載體DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析確保酶切完全，純化得到的線性化質粒DNA，之后，采用電轉化法轉化畢赤酵母KM71，將電擊后的菌體涂布在不含組氨酸的MGY平板上置于30°C培養至單個菌落出現；
挑取其中單菌落于MGY培養液中，30°C振蕩培養20小時時，收集細胞，在含15%甘油的MGY中懸浮，先用液氮冰凍再于_80°C長期保存；
(3)重組菌的培養與表達
發酵前，將重組菌從-80°C取出，在MGY平板上劃線30°C培養至單菌落出現，挑取單菌落接種于BMGY培養液中，30°C下快速振蕩培養20小時，2500g離心5分鐘，收集菌體，用BMMY培養液重懸至OD6tltlnm約1.0，30°C下快速振蕩培養20小時后加入甲醇至終濃度為
1.0%，此后每24小時向培養基中加入甲醇至終濃度1.0%，繼續培養96小時，離心收集菌體；
(4)金屬硫蛋白的純化
用0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)重懸收集到的菌體，并用超聲波破碎儀破碎細胞，室溫下18000rpm離心30分鐘，收集上清，上清通過用0.05mol/L的Trics-HCl (pH7.0)平衡的葡聚糖凝膠，收集分子量小于1000OKda的蛋白洗脫峰,利用CM-Sephadex再次分離收集到的蛋白樣品，用含0.1mol/LNaCI的Trics-HCl (ρΗ7.0)洗柱后，用含0.5mol/LNaCl的Trics-HCl (pH7.0)洗脫蛋白，收集洗脫峰，利用SDS-PAGE檢測目的蛋白所在的洗脫峰，將該洗脫峰通過超純水平衡的葡聚糖凝膠進行脫鹽，最后將含目的蛋白的洗脫峰利用反向高效液相層析進行分離，用0.05%三氯乙酸+乙腈(30%~60%) +水(60%~30%)的梯度進行洗脫，收集到的金屬硫蛋白純度高達98%，純化后的金屬硫蛋白進行SDS-PAGE檢測得到分子量約6.2Kda的單一條帶，按照此發明方法，在搖瓶發酵水平上，每升發酵液可得到42mg的金屬硫蛋白。
【權利要求】
1.一種多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體，其特征在于:該重組表達載體的獲得方法是:將按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計金屬硫蛋白的編碼序列，將所設計的金屬硫蛋白基因插入載體PA0815上的EcoRI位點后，得到含單拷貝金屬硫蛋白表達盒的表達載體，用限制性內切酶Bgl II及BamH I從得到的單拷貝表達載體上分離金屬硫蛋白表達盒，將其再次插入到單拷貝表達載體的BamH I位點，得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，重復上述插入程序構' 建出多拷貝表達的金屬硫蛋白表達盒數目逐漸增加的重組表達載體。
2.根據權利要求1所述的一種多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體，其特征在于所設計的金屬硫蛋白的編碼序列是SEQ ID N0.1。
3.一種高效表達金屬硫蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)構建多拷貝的金屬硫蛋白重組表達載體: 將按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計金屬硫蛋白的編碼序列，將所設計的金屬硫蛋白基因插入載體PA0815上的EcoRI位點后，得到含單拷貝金屬硫蛋白表達盒的表達載體，用限制性內切酶Bgl II及BamH I從得到的單拷貝表達載體上分離金屬硫蛋白表達盒，將其再次插入到單拷貝表達載體的BamH I位點，得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，重復上述插入程序構建出多拷貝表達的金屬硫蛋白表達盒數目逐漸增加的重組表達載體； (2)將(I)中構建的重組表達載體轉化畢赤酵母GS115或KM71中，在不含組氨酸的培養基上篩選到重組菌； (3)將(2)篩選到的重組菌接種于BMGY培養液，28~30°C下快速振蕩培養16~20小時，1500~3000g離心5分鐘，收集菌體，用BMMY培養液重懸，稀釋至OD6tltol約1.0，28~30°C下快速振蕩培養至對數期加入甲醇至終濃度0.5%~1.5%，此后，每24小時向培養基中加入甲醇繼續培養96~150小時； (4)收集菌體，超聲破碎，離心收集上清，可從上清中分離純化到金屬硫蛋白。
4.一種高效表達金屬硫蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)重組表達載體的構建 將金屬硫蛋白的編碼序列，按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計和合成，然后，PCR擴增金屬硫蛋白編碼序列，通過酶切、連接，將基因插入到載體PA0815上的EcoRI位點后，構建成含單拷貝金屬硫蛋白表達盒(pAOXl及金屬硫蛋白編碼序列)的表達載體； 用限制性內切酶Bgl II及BamH I從上述構建的表達載體上分離金屬硫蛋白表達盒，將其再次插入上述表達載體的BamH I位點上，得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，重復該插入程序可構建出一系列金屬硫蛋白表達盒數目逐漸增加的重組表達載體； (2)重組菌的構建 選擇限制性內切酶線性化重組質粒DNA，之后，利用電轉化法將線性化重組質粒DNA轉入畢赤酵母GS115或KM71中，利用表達載體上His4基因與宿主的互補效應，在不含組氨酸的平板上篩選得到轉化子，必要時利用PCR技術驗證重組的發生； (3)重組菌的培養與誘導表達 將上述重組菌接種于BMGY培養液中，28~30°C下快速振蕩培養至OD6tltol=Z~6時，.1500~3000g離心5分鐘，收集菌體，用BMMY培養液重懸，稀釋至OD6tltlnm約1.0，28~30°C下快速振蕩培養至對數期加入甲醇至終濃度為0.5%-1.5%，此后，每24小時向培養基中加入甲醇至終濃度0.5%~1.5%，繼續培養96小時~150小時，離心收集菌體； (4)金屬硫蛋白的純化 利用超聲破碎儀破碎上述收集到的菌體，離心收集上清，并通過分子篩-離子交換層析-分子篩-反向高效液相層析純化金屬硫蛋白，純度高達98%，SDS-PAGE檢測呈單一條帶狀態。
5.一種高效表達金屬硫蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)重組表達載體的構建 首先，將金屬硫蛋白編碼序列，按照畢赤酵母密碼子偏好性重新設計和合成，然后，PCR擴增金屬硫蛋白編碼序列，通過酶切、連接，將基因插入到載體PA0815上的EcoRI位點后，轉化感受態大腸桿菌ToplOF’,在含50ug/ul Amp的LB平板上篩選Amp抗性克隆,挑取Amp抗性轉化子，接種在含50ug/ul Amp的培養基，37°C振蕩培養過夜，提取質粒DNA ； 以上述質粒DNA為模板，5’ AOXl及3’ AOXl為測序引物進行測序驗證目的基因的正確插入； 用限制性內切酶Bg l II及BamH I從上述構建的表達載體上分離出金屬硫蛋白表達盒(pAOXl及金屬硫蛋白編碼序列)，將其再次插入上述表達載體的BamH I位點上，轉化感受態大腸桿菌ToplOF’，篩選Amp抗性克隆，提取其質粒得到兩個金屬硫蛋白表達盒串聯在一起的表達載體，利用同樣的方法重復該過程得到三個金屬硫蛋白表達盒串聯的重組表達載體； (2)重組菌的構建 選擇限制性內切酶Sac I線性化上述含三個表達盒的表達載體DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析確保酶切完全，純化得到的線性化質粒DNA，之后，采用電轉化法轉化畢赤酵母KM71，將電擊后的菌體涂布在不含組氨酸的MGY平板上置于30°C培養至單個菌落出現； 挑取其中單菌落于MGY培養液中，30°C振蕩培養20小時時，收集細胞，在含15%甘油的MGY中懸浮，先用液氮冰凍再于_80°C長期保存； (3)重組菌的培養與表達 發酵前，將重組菌從-80°C取出，在MGY平板上劃線30°C培養至單菌落出現，挑取單菌落接種于BMGY培養液中，30°C下快速振蕩培養20小時，2500g離心5分鐘，收集菌體，用BMMY培養液重懸至OD6tltlnm約1.0，30°C下快速振蕩培養20小時后加入甲醇至終濃度為.1.0%，此后每24小時向培養基中加入甲醇至終濃度1.0%，繼續培養96小時，離心收集菌體； (4)金屬硫蛋白的純化 收集到的菌體，破碎細胞，分離純化金屬硫蛋白。
【文檔編號】C12R1/84GK103898153SQ201210579512
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2012年12月28日
【發明者】唐東起, 崔泰興, 吳琦, 葛瑞蕾, 趙亞茹 申請人:山東東興生物科技股份有限公司