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一種優化的、高效率的農桿菌介導的花生轉化方法與流程

文檔序號:11145439閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:包括以下操作步驟:

(1)活化、重懸待轉化的重組農桿菌菌液,調整OD600值為0.5~0.8;用酒精、升汞依次處理花生子葉外植體;用無菌水沖洗干凈后浸泡2.5h;縱切后將子葉胚芽節點處切除得到待轉化外植體;

(2)用加有煙草提取物的農桿菌菌液侵染步驟(1)獲得的外植體5~15min,侵染同時進行超聲波處理2~8min,去除多余的菌液后,將其置入共培養基中,26℃條件下暗培養2~4d;

(3)共培養后,將外植體取出用含100~300mg/L Cef和300~500mg/L Carb的無菌水沖洗4~5遍后,用滅菌濾紙吸干,接到含100~300mg/L Cef和300~500mg/L Carb的抗性芽誘導培養基上,在26℃、16h光照條件下選擇培養14d;當有綠色芽點形成后,去除子葉,在誘導培養基上每兩周繼代一次;

(4)當綠色芽點生長到1~2cm后,接種到分化培養基上促進芽分化及伸長,隨著芽叢的繼續生長,將其切分成小塊,每兩周繼代一次,繼續分化培養;

(5)當誘芽長至3~4cm高并有3~4片小葉時,將誘芽切下,轉接到生根培養基誘導生根,待幼苗根系發育完全,洗凈根上的培養基,移栽到含滅菌沙土的花盆中;每個月用Hoagland營養液澆一次,同時每十天用自來水澆灌一次。

2.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:步驟(2)所述超聲波處理的功率為50w,工作頻率為40KHz。

3.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:所述共培養基為改良的MS培養基,其中添加1~2mg/L ZT、4~8mg/L 6-BA、0.1~0.5g/L酪蛋白水解物、0.05~0.15g/L肌醇,pH值為5.2。

4.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:所述抗性芽誘導培養基為改良的MS培養基,其中添加1~2mg/L ZT、4~8mg/L6-BA、0.1~0.5g/L酪蛋白水解物、2~4g/L L-脯氨酸、0.05~0.15g/L肌醇、0.1~0.3mmol/L維生素C、0.1~0.4mmol/L GSH、0.02~0.1mmol/L維生素E,pH值為5.8。

5.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:所述分化培養基為改良的MS培養基,其中添加100~300mg/L Cef、300~500mg/L Carb、1~2mg/L ZT、1~2mg/L NAA、1~3mg/L KT、1~4g/L酪蛋白水解物、0.05~0.15g/L肌醇、20~40g/L山梨醇、0.1~0.3mmol/L維生素C、0.1~0.4mmol/L GSH、0.02~0.1mmol/L維生素E,pH值為5.8。

6.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:所述生根培養基為改良的1/2MS培養基,其中添加1~2mg/L NAA、0.05~0.15g/L肌醇,pH值為5.8。

7.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:所述滅菌沙土成分重量比是沙:土:蛭石:珍珠巖為10:10:1:1。

8.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:步驟(1)所用的酒精、升汞處理方法為,用70%~75%酒精處理花生子葉外植體1~2min,之后用0.1%~0.2%升汞處理子葉外植體10~20min。

9.一種農桿菌介導的花生轉化方法,其特征在于:步驟(2)所述加有煙草提取物的農桿菌菌液為,每100ml農桿菌菌液中添加煙草提取物1~3ml。

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