本發明涉及轉基因工程技術領域，具體涉及一種涂抹劑及其在篩選水稻T₀代轉基因突變植株中的應用。

背景技術：

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palir dromic repeats/CRISPR-associated Cas9,成簇規律間隔的短回文重復序列/Cas9核酸酶)技術可以準確重新編碼DNA序列，不僅是一項先進的生物學技術，同時也是改良農作物品質的有效手段(Bogdanove and Voytas,2011；Carroll 2011)，在水稻研究領域有著重要的應用價值。

CRISPR/Cas9體系主要是借助sgRNA(single guide RNA)來匹配到基因組特定的位置，之后Cas9核酸酶便會將DNA切斷形成雙鏈切口。DNA損傷導致細胞啟動修復工作，在這一過程中會便會引入突變。可見，能否形成突變體的因素很多：Cas9內切酶的活性(量的多少)、修復能力等。

申請號為201610597205.1的專利文獻公開了一種重組載體，該重組載體在含有sgRNA基因、Cas9基因和篩選標簽基因的CRISPR/Cas9載體上插入攜帶有BelRNAi表達元件，該BelRNAi表達元件轉錄產生干擾苯達松抗性基因的發夾狀RNA干擾片段。利用對除草劑苯達松表現敏感致死，在T₁代植株篩選時噴灑苯達松，獲得既保留了目的基因突變，又不含有轉基因片段的后代。

本課題組研究發現，針對不同的靶點基因，不同的水稻品種，T₀代植株的突變概率最大可以接近1/2，最小甚至不足1％。目前篩選突變體常用的方法就是直接進行PCR擴增并測序，如上述專利文獻中介紹，首先對轉基因得到的植株提取DNA，以HgyR作為標記基因設計引物進行PCR擴增，篩選到含有重組載體的轉基因植株，再以靶點基因序列設計引物進行PCR擴增測序篩選。此方法不僅工作量大，而且效率極低。

因此，如何快速有效地從T₀代群體中篩選出突變體成為困擾轉基因工作者的一個問題。

技術實現要素：

針對現有的技術不足，本發明提供了一種適用水稻葉片的涂抹劑，涂抹于T₀代水稻植株的葉片上，通過觀察葉片是否對涂抹劑產生敏感反應來篩選含有重組載體的轉基因植株，而且越敏感越有可能是陽性植株突變體，該方法直觀有效，顯著提高篩選效率。

本發明提供了一種適用水稻葉片的涂抹劑，以水為溶劑，每升水中溶有500～2000mg苯達松和體積占比3～6％的吐溫。

本發明涂抹劑中苯達松的濃度可根據具體涂抹葉片的苗齡來調整，如處理1個月大小的植株時，采用苯達松濃度為1000mg/L的涂抹劑。

苯達松為接觸性除草劑，只有接觸部位才會受傷，本發明提供的涂抹劑只是針對像水稻葉片這樣的疏水性很強的植株表面上使用，因此必須要求具有一定的粘附性。如粘附不住，涂抹劑流入土壤中，會危害整個植株的生長，不利于水稻T₀代轉基因突變植株的存活。

本發明研究證明吐溫(或聚山梨酯)作為非離子型表面活性劑，不僅能夠幫助苯達松停留在植株葉片表面，而且不影響苯達松發揮功能。吐溫的配比非常關鍵，當濃度過低，涂抹劑無法粘附在葉片上，當濃度大于10％，無論是陽性植株還是正常植株，葉片都會出現發黑癥狀，無法區分。作為優選，所述吐溫選用吐溫-20。更為優選，所述吐溫-20的體積比為6％。

制備涂抹劑時，按上述配比添加原料后，利用毛筆進行攪拌打出泡沫后，再涂刷到水稻葉片上。研究實驗表明，本發明的涂抹劑打出泡沫后進行涂覆的粘附效果比簡單混合(如上下混勻)的方法要好。

本發明還提供了一種水稻T₀代轉基因突變植株的篩選方法，包括：

(1)將重組載體通過農桿菌介導轉入水稻植株中，獲得T₀代植株；

(2)T₀代植株培育至長出多張葉片時，將所述的涂抹劑涂抹在其中一張葉片上，繼續培育3～4天之后觀察；

如涂有涂抹劑的葉片出現卷曲、萎縮的敏感癥狀，則判斷該T₀代植株為含有重組載體的轉基因植株；如涂有涂抹劑的葉片正常生長，則判斷為無效植株；

(3)提取含有重組載體的轉基因植株DNA，對靶點區域進行PCR擴增后，經測序，確定轉基因植株中sgRNA錨定的靶點區域的序列，從中挑取已發生突變的序列所對應的植株，獲得T₀代突變植株；

所述重組載體為攜帶有BelRNAi表達元件和靶點序列sgRNA的CRISPR/Cas9載體。

除草劑苯達松的作用靶點是光合系統，正常水稻的基因組中含有可以解除毒性的苯達松抗性基因CYP81A6/Bel(Os03g0760200)，使得苯達松處理后的水稻依舊能夠存活，表現出抗性；但是，若該抗性基因突變或者RNA水平沉默，則會表現出苯達松敏感。

本發明在原始載體中引入BelRNAi單元(即BelRNAi表達元件)，轉入水稻植株后，BelRNAi表達元件可以轉錄形成發夾結構，與水稻細胞內存在的Bel RNA匹配，打斷其片段，影響翻譯，使水稻表現出苯達松敏感。因此，在進行苯達松除草劑篩選時，若T₀代植株葉片表現出敏感，則為攜帶轉基因成分的植株。同時，我們通過實驗進一步證明了，越是敏感越有可能是突變體的理論基礎，大大縮小篩選范圍。

由于敏感植株對苯達松表現致死性，如果使用常規的對整個植株進行噴灑的方法，那么本發明需要篩選的目標植株就表現致死，則無法進行下一步的篩選，因此，本發明采用對植株的部分葉片進行涂抹，在不影響植株生長的前提下，又能觀察對除草劑苯達松的反應。

作為優選，步驟(2)中，將T₀代植株培育一個月后涂抹涂抹劑。將步驟(1)中獲得的T₀代植株轉移到外界生長，需要一個適應期，而且生長一個月后，長出大概4張，涂抹其中一張，這張葉片致死的情況下不會影響植株繼續生長。

苯達松的有效成分主要通過植株葉片吸收。作為優選，所述涂抹劑涂抹在T₀代植株中心的其中一張葉片表面。中心處的葉片比較嫩，對藥劑更加敏感，邊上的老葉本身會有局部黃色等性狀，會干擾觀察。

作為優選，步驟(2)中，將涂抹劑攪拌出泡沫后進行涂抹。

作為優選，所述原始載體為pHun4c12，其已經在水稻中成熟運用。

作為優選，所述BelRNAi表達元件中啟動子為d35S，終止子為NOS Terminal。這兩個元件應用廣泛而且被成熟地運用于載體改造中。

本發明采用的BelRNAi基因的堿基序列以及重組載體的構建方法均記載上申請號為201610597205.1的專利文獻中。

本發明方法利用水稻葉片對苯達松是否敏感即可分辨該植株是否轉基因成功，而且當植株表現出對苯達松的敏感癥狀時，說明不但轉基因成功而且插入的序列在發揮作用，無疑增加了靶位點發生突變的篩選幾率。相較于對每個植株進行PCR擴增再測序的方法，本發明方法有效縮小篩選范圍，大大提高獲得突變體植株的概率。

本發明對使用苯達松涂抹后沒有表現敏感癥狀的植株進行靶基因測序，確實沒有發現突變，證明本發明方法可以避免假陰性問題。

本發明在研究中發現，涂抹苯達松的葉片表現的敏感程度越高，該植株為突變體的可能性越高，以此為原則可以進一步地縮小篩選范圍。機理分析：Cas9基因和Bel hpRNAi是共線的，在轉錄水平上會具有一致性。Cas9轉錄越多，可能越有利于突變體的產生。這個Cas9的轉錄可以間接通過Bel hpRNAi的量反應出來，Bel hpRNAi的高豐度會導致水稻細胞中Bel受到干擾，表現出除草劑苯達松的敏感。因此，敏感癥狀越明顯也就意味著突變體可能性越大。

本發明具備的有益效果：

(1)本發明利用BelRNAi表達元件使得水稻轉基因植株對苯達松表現敏感的特點，在待篩查的T₀代水稻部分葉片上涂抹苯達松，觀察其是否表現敏感癥狀來判斷是否為目標植株，本發明方法操作簡單，結果容易判斷，適合批量篩選，極大減少工作量，而且材料成本更低。

(2)本發明提供的涂抹劑在苯達松水溶液中添加適量吐溫-20，增加其粘稠度，使其有效粘附在水稻葉片表面，保證涂抹劑只對葉片作用而不影響整個植株的生長，保持T₀代有效植株的存活。

(3)相對于傳統方法，本發明方法有效縮小篩選范圍，而且不存在假陰性的問題，大大提高篩選效率。

附圖說明

圖1為實施例1中T₀代水稻植株對苯達松表現敏感癥狀的圖片，其中A為整個植株的圖片，B圖中左邊葉片為未涂抹苯達松，右邊葉片為涂抹苯達松。

圖2為實施例1中T₀代水稻植株對苯達松表現不敏感的圖片，其中A為整個植株的圖片，B圖中左邊葉片為未涂抹苯達松，右邊葉片為涂抹苯達松。

圖3為各類型T₀代水稻植株Cas9表達量的比較圖。

圖4為各類型T₀代水稻植株Bel表達量的比較圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。

重組載體的構建

1、BelRNAi基因轉錄單元的制備

這里用到的RNA干擾主要是通過引入300bp長度的發夾(Hairpin)結構來干擾細胞內的Bel轉錄本。

用引物Beli-F1(gagctcAGCTTAGCCATGGATAACGCCTAC,小寫下劃線為Sac Ⅰ酶切位點)和Beli-R1(ctgcagAAGGTCACGTCGTGCTCGGTGAAGCACTC,小寫下劃線為Pst Ⅰ酶切位點)，經PCR擴增獲得正向序列。

另一方面，用引物Beli-F2(ggtaccAGCTTAGCCATGGATAACGCCTAC,小寫下劃線為Kpn Ⅰ酶切位點)和Beli-R2(ctcgagAAGGTCACGTCGTGCTCGGTGAAGCACTC,小寫下劃線為Xho Ⅰ酶切位點)。上述引物的堿基序列分別如SEQ ID NO.1～4所示。

測序正確之后，將序列裝進PCAMBIA-1301，與其載體上的d35S和NOS terminal拼裝，最終形成完整功能單元d35S-BelRNAi-NOS terminal。

2、重組載體的構建

將這個完整單元用EcoRI和HindⅢ酶切之后，裝進已經被HpaI切開的原始載體

pHun4c12，形成pHun4c12-Beli載體。

實施例1

1、獲取T₀代植株

以Phosphatidylinositol transfer基因(Os05g0545000)作為靶基因，在pHun4c12-Beli載體上插入20bp的片段如SEQ ID NO.5所示作為sgRNA，具體為：AAATGCAAGTGCGAGGCATT，以期獲得該基因突變的植株。

通過農桿菌介導的方法進行轉基因，主要方法參照Li et al.(2014).(Li W.X.,Huang J.Z.,Zhao H.J.,Tan Y.Y.,Cui H.R.,Poirier Y.,Shu Q.Y.,2014.Production of low phytic acid rice by hairpin RNA-and artificial microRNA-mediated silencing of OsMIK in seeds.Plant Cell Tiss.Organ Cult.,119:15-25)。

在T₀代中，一方面，sgRNA在啟動子U3的啟動下會轉錄出來，并匹配到基因Phosphatidylinositol transfer上；Cas9基因也在水稻細胞中轉錄翻譯出來核酸酶，兩者協同作用，切割靶點，之后水稻細胞DNA修復過程中引入突變。另一方面，Bel RNAi發夾結構轉錄出來形成RNA，與水稻細胞內存在的Bel RNA匹配，打斷其片段，影響翻譯。

通過上述方法獲得了96株T₀代水稻植株。

2、轉基因植株篩選

制備涂抹劑：以水為溶劑，苯達松濃度設置為1000mg/L，加入6％(V/V)吐溫-20提高粘稠度，利用毛筆攪拌打出泡沫。

將獲得的96株T₀代水稻植株水培一個月后的植株進行苯達松涂抹。涂抹方法：對最上兩張葉片的一張進行涂抹，一手托住葉片，用毛筆蘸取溶液均勻涂布在葉片上。

三至四天之后進行觀察，葉片的癥狀反應程度可能會因植株大小等因素不一致，選取群體中反應強烈的即可。

如圖1所示，涂有苯達松的葉片出現卷曲，萎縮的癥狀，而不涂的葉片沒有癥狀，植株能夠正常生長。

圖2是表現出不敏感的植株的葉片，幾乎沒有差異。

根據是否敏感，分成兩類，敏感的植株有51株，剩下45株不敏感。我們對51株進行測序之后，發現13株是突變體aa型(含aa')，15株是Aa型，23株是AA型(記為AA-S)。

為了防止有突變體遺漏在不敏感的植株中造成假陰性，我們進一步對45株不敏感的植株(記為AA-R)都進行了靶基因測序，確實沒有發現突變。因此，此方法在假陰性問題上還是可以控制的。

之后，進一步從四個分類中(aa type；Aa type；AA-S；AA-R)選出10株進行后續實驗，主要是測定兩個基因Cas9和Bel的表達水平。

從圖3中可見，突變體植株aa型有最高的Cas9表達量，而Aa型植株中Cas9也有著較高水平(兩者之間并沒有差異)，可能正是因為Cas9有著較高的突變容易導致突變產生。盡管AA-S也表現出苯達松敏感，但其表達量較低還是不足以誘發突變。不敏感的AA型植株(AA-R)中Cas9表達更低，更加不可能引發突變體。

從圖4中可見，以Bel基因出發，由于受到RNA干擾，突變體植株aa型中的Bel表達量最低，Aa型的植株中Bel的表達也很低。兩者相近，這與兩者中Cas9表達相近一致。敏感AA-S中，Bel基因也一定程度上被干擾。在AA-S群體中，Bel的表達量和Cas9的表達量一樣，都是處于一個中間狀態。AA-R群體中，Bel表達更不受影響，因此也沒有敏感癥狀。

上述實驗證明了，Cas9的量與Bel的量是負相關的，我們可以通過越是敏感越有可能是突變體的原則來縮小篩選范圍。可以將篩選概率從原來的28/96(96株中選出28株突變體)提高到25/51(51株敏感的植株直接通過測序發現25株突變體)。

實施例2

參照實施例1的方法，用pHun4c12-Beli對基因14-3-3C(Os08g0430500)進行定點突變誘導。sgRNA靶點位置的堿基序列如SEQ ID NO.6所示，具體為：ACTCTGATCAAGGAGTACCG。用同樣的方法發現，48株T₀代植株中，有21株表現出苯達松敏感，21株測序后發現16株是突變體(含Aa，aa型)。剩下的27株植株也全部測序并沒有發現突變體，也即不存在假陰性的問題。可以將篩選范圍從16/48提高到16/21，概率提高2倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大學

<120> 一種涂抹劑及其在篩選水稻T0代轉基因突變植株中的應用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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