本發(fā)明涉及一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物血液中微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CirculatingTumor Cell，CTC）的特異性方法。

背景技術(shù)：

一般人們所說(shuō)的“癌癥”習(xí)慣上泛指所有惡性腫瘤，而腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤研究工作的困境之一，超過(guò)90%的癌癥患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，也是臨床絕大多數(shù)腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞入侵到原發(fā)腫瘤細(xì)胞的周?chē)M織中，進(jìn)入血液和淋巴管系統(tǒng)，形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC，并轉(zhuǎn)運(yùn)到遠(yuǎn)端組織，再滲出，適應(yīng)新的微環(huán)境，最終“播種”、“增殖”、“定植”、形成轉(zhuǎn)移灶。因此早期發(fā)現(xiàn)血液中的CTC，對(duì)于患者預(yù)后判斷、療效評(píng)價(jià)和個(gè)體化治療都有著重要的指導(dǎo)作用。

目前，新興的CTC檢測(cè)技術(shù)，已成為研究熱點(diǎn)并進(jìn)入臨床應(yīng)用。已經(jīng)建立的CTC檢測(cè)方法包括：聚合酶鏈反應(yīng)和流式細(xì)胞術(shù)（Cell search系統(tǒng)）。但是，儀器的高成本、費(fèi)力且耗時(shí)較長(zhǎng)仍然嚴(yán)重制約著CTC作為腫瘤早期診斷的指標(biāo)在臨床中的應(yīng)用。因此，有必要提供一種低成本、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高及特異性強(qiáng)的檢測(cè)微量CTC的方法。

近年來(lái)，核酸適配體引起了很大的關(guān)注。?核酸適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的寡核苷酸序列（RNA和ssDNA），具有特殊的三級(jí)結(jié)構(gòu)，能與相應(yīng)的配體進(jìn)行強(qiáng)特異性和高親和力的結(jié)合。作為一種新型的功能分子探針，核酸適配體因具有易合成及修飾、強(qiáng)穩(wěn)定性、低成本等特點(diǎn)，而被認(rèn)為是抗體的理想替代品。可見(jiàn)，適配體技術(shù)及其在生物醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，可用于特異性識(shí)別靶細(xì)胞（尤其是癌癥細(xì)胞），用于診斷治療及生物傳感等。

基于適配體可特異性地識(shí)別癌癥細(xì)胞的特點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)對(duì)血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離。免疫磁珠分離技術(shù)是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高及純化性好的的免疫學(xué)檢測(cè)方法和抗原純化手段。目前，該項(xiàng)技術(shù)在細(xì)胞分離、蛋白、免疫學(xué)及微生物學(xué)檢測(cè)等方面均取得了較大的進(jìn)展，是最有推廣價(jià)值的技術(shù)之一。其中，免疫磁珠分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。

滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification，RCA）是一種高效的恒溫核酸擴(kuò)增手段，且可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)DNA或RNA的指數(shù)擴(kuò)增，通過(guò)結(jié)合生物標(biāo)記等，有效地放大信號(hào)，極大地增強(qiáng)了檢測(cè)靈敏度。近幾年，RCA在功能性核酸的制備、生物傳感及納米材料等領(lǐng)域有著越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，RCA技術(shù)的發(fā)展得益于其自身高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，并且可以與其它高新技術(shù)（如表面修飾技術(shù)、熒光檢測(cè)技術(shù)及納米技術(shù)等）相結(jié)合，開(kāi)辟更好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明方法將適配體特異性識(shí)別結(jié)合相應(yīng)配體的特點(diǎn)、免疫磁珠的捕獲技術(shù)及RCA技術(shù)相結(jié)合用于微量CTC檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、成本低的特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物血液中微量CTC的特異性方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

（1）微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)蛋白高特異性結(jié)合適配體AP的設(shè)計(jì)與合成：以待測(cè)血樣外周血CTC表面高表達(dá)的蛋白為模板，基于Cell-SELEX技術(shù)，設(shè)計(jì)可與該蛋白高特異性結(jié)合的適配體AP；

依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，設(shè)計(jì)可與AP連接成多環(huán)的引物DNA1、DNA2；其中，DNA1和DNA2有兩段相同的序列片段①和②，依據(jù)片段①設(shè)計(jì)滾環(huán)擴(kuò)增引物（RCA primer），依據(jù)片段②設(shè)計(jì)分子信標(biāo)（MB）；

（2）適配體AP成環(huán)反應(yīng)得到^CAP，使用同種方法得到環(huán)^CDNA1和環(huán)^CDNA2；

（3）DNA納米器件PDN的制備：將步驟（2）中得到的^CAP、^CDNA1、^CDNA2以1:1:1-1:5:5的摩爾比混合，雜交，得到DNA納米器件（PDN）；

（4）微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞所在的單核細(xì)胞層的分離：將待測(cè)血樣用梯度分離液處理后，分離出目標(biāo)CTC所在的單核細(xì)胞層；

（5）DNA納米器件PDN標(biāo)記單核細(xì)胞層中的目標(biāo)細(xì)胞CTC：將步驟（4）分離出的細(xì)胞與步驟（3）的產(chǎn)物PDN以及特異性的免疫磁珠混合共孵育；

（6）免疫磁珠法分離PDN標(biāo)記的CTC：利用免疫磁珠分離技術(shù)洗脫步驟（5）孵育液得到結(jié)合有PDN的目標(biāo)細(xì)胞；

（7）滾環(huán)擴(kuò)增法測(cè)定微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞數(shù)：在步驟（6）產(chǎn)物加入RCA primer進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，將分子信標(biāo)MB加入滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物中孵育，在堿基互補(bǔ)的競(jìng)爭(zhēng)作用下，MB的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，熒光信號(hào)釋放后，檢測(cè)熒光值，以此判斷CTC的數(shù)量。

使用本發(fā)明的方法，可以快速、高效地檢測(cè)癌癥患者外周血中CTC的數(shù)量。本發(fā)明的檢測(cè)方法，避免了使用PCR儀、流式細(xì)胞儀等大型昂貴儀器及耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，有效降低了癌癥患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC的檢測(cè)成本。

本發(fā)明所述的檢測(cè)方法便宜、簡(jiǎn)單，且與已有的檢測(cè)方法相比，新方法所用時(shí)間短，具有高特異性、超靈敏的特點(diǎn)。本發(fā)明可用于癌癥患者外周血中微量CTC的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1：為本發(fā)明所述的PDN的各單獨(dú)組分及PDN的電泳圖（聚丙烯酰胺凝膠為12%）。圖中：Maker泳道的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Low Molecular Weight DNA Ladder）；1泳道為：^CDNA2；2泳道為：^CDNA1；3泳道為：^CAP；4泳道為：^CDNA1+^CDNA2；5泳道為：PDN。

圖2：圖A表示的是熒光值與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系圖，圖B表示的是在518nm處的熒光最大吸收值與CTC數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

下面結(jié)合實(shí)施例，便于更好地說(shuō)明本發(fā)明。

乳腺癌病人外周血CTC的檢測(cè)新方法的建立

一、引物設(shè)計(jì)

以待測(cè)病人血樣CTC表面高表達(dá)的蛋白Epcam為模板，基于Cell-SELEX技術(shù)，設(shè)計(jì)可與Epcam蛋白高特異性結(jié)合的適配體EAD，EAD的序列為：CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTGGAATCAATCTGAATCAATCTACGACGTACTCCTAACTAGCT；

依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，設(shè)計(jì)可與EAD連接成多環(huán)的引物DNA1、DNA2；其中，DNA1和DNA2有兩段相同的序列片段①和②，依據(jù)片段①設(shè)計(jì)滾環(huán)擴(kuò)增引物（RCA primer），依據(jù)片段②設(shè)計(jì)分子信標(biāo)（MB）。

所用到的引物序列如下：

DNA1：

TAGACTTAGTTAGATGCTGCTCCGCCCGTCCCACGTACTTTTTATGTTCTCTCTCTTGCCTCTGtcccacgtccgtctc

DNA2：

GGCAAGAGAGAGAACATAAATCCGCCCGTCCCACGTACTTATCTGAATCAATCTACGACGtcccacgtccgtctc

RCA-primer：AGGGTGCAGGCAGAG

MB：(FAM)GAGTCGCTCCGCCCGTCCCACGTACTTTTAAG GCGACTC(DABCYL)

二、適配體環(huán)化與PDN合成

將稀釋為10μM的EAD進(jìn)行成環(huán)反應(yīng)，得到環(huán)^CEAD，使用同種方法得到環(huán)^CDNA1和環(huán)^CDNA2；再將得到的^CEAD、^CDNA1和^CDNA2以1:3:3摩爾比混合，反應(yīng)條件為：90℃退火5min，降至室溫，37℃反應(yīng)1h，得到PDN產(chǎn)物。

成環(huán)反應(yīng)的具體步驟如下：

（1）磷酸化反應(yīng)：取1.5ml 離心管，分別加入ddH₂O 76.5μl、10×Polynucleotide Kinase Buffer 10μl、ATP 3μl、T₄ Polynucleotide Kinase 3μl及Aptamer 7.5μl，總體系為100μl。混勻后置于恒溫金屬浴37℃振蕩反應(yīng)30min后，90℃退火5min，降至室溫。

（2）Ligase連接：在上述aptamer磷酸化產(chǎn)物中加入10×Ligase Buffer 15μl、Templete 10μl及ddH₂O 21μl，混勻，置于恒溫金屬浴90℃退火5min，55℃振蕩反應(yīng)2h。待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后，加入T₄ DNA Ligase 4μl，于金屬浴16℃反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，65℃失活10min，降至室溫。

（3）去templete：在上述反應(yīng)體系中繼續(xù)加入ddH₂O 27μl、10×T₄ Polymerase Buffer 15μl及T₄ Polymerase 3μl，混勻后于恒溫金屬浴37℃振蕩反應(yīng)16h，結(jié)束后85℃失活10min，降至室溫。

（4）產(chǎn)物純化：上述反應(yīng)終體系約200μl，加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液（20μl）和2.5體積無(wú)水乙醇（500μl），充分混勻后，豎直放置于-20℃1h，結(jié)束后于4℃ 15,000g離心30min，棄去上清，保留底部沉淀。沉淀用500μl 的70%乙醇（-20℃）打散，于4℃ 15,000g離心30min，棄去上清，保留底部沉淀，重復(fù)此步驟一次。最后，將產(chǎn)物置于真空泵離心濃縮儀中旋轉(zhuǎn)干燥。使用時(shí)加入50μl ddH₂O溶解即可。

三、免疫磁珠的選擇

根據(jù)所需檢測(cè)的CTC的類(lèi)型，訂購(gòu)成品的可與CTC相結(jié)合的免疫磁珠。

四、CTC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將乳腺癌BT474細(xì)胞放入血液中來(lái)模擬CTC。

將不同濃度梯度的BT474細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)量為0、10、50、100、500、1.0×10³、5.0×10³、1.0×10⁴、5.0×10⁴、1.0×10⁶）分別與10μl PDN在37℃孵育2h。反復(fù)低速離心3次，洗去未結(jié)合的PDN。在孵育液中10μM 的RCA-primer 6μL 室溫靜置0.5h，隨后加入10μM 的RCA-primer 6μL、10 mM 的dNTP 3μL、5 u/μL 的phi29 polymerase 0.5μL、phi29 DNA polymerase buffer (10×) 5μL以及ddH₂O使總體積為200μL在37℃滾環(huán)反應(yīng)4h。

將稀釋為10μM的MB 6μL加入上述步驟的滾環(huán)反應(yīng)產(chǎn)物中，90℃退火5min，室溫放置1h后，利用熒光光譜儀，檢測(cè)熒光值（熒光檢測(cè)條件為：發(fā)射波長(zhǎng)518nm，檢測(cè)范圍500-600nm，室溫）。

由此得到的熒光值與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系圖及CTC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示，可以看出熒光值隨細(xì)胞數(shù)量增加而增大。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的的線(xiàn)性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R²可以看出，BT474細(xì)胞數(shù)量與熒光值存在線(xiàn)性正相關(guān)關(guān)系，故可將此回歸方程用于血樣中CTC數(shù)量的計(jì)算。

五、PDN在臨床血樣檢測(cè)中的應(yīng)用

依據(jù)本發(fā)明方法對(duì)隨機(jī)不同腫瘤分期的三個(gè)臨床患乳腺癌病人的血樣進(jìn)行檢測(cè)，把檢測(cè)的熒光值（518nm的最大吸收值）代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出血樣中所含的CTC數(shù)量，得到的結(jié)果如表1所示。

表1 本方法對(duì)隨機(jī)不同分期的癌癥病人血樣CTC檢測(cè)的結(jié)果

從臨床血樣檢測(cè)結(jié)果可以看出，由本發(fā)明方法所檢測(cè)到的CTC數(shù)量與癌癥病人的腫瘤分期是相符合的，因此本發(fā)明的方法具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的方法，依據(jù)CTC表面高表達(dá)的蛋白和Cell-SELEX技術(shù)設(shè)計(jì)的環(huán)狀特異性適配體可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的強(qiáng)特異性，且基于多環(huán)連接的RCA的應(yīng)用，進(jìn)行熒光檢測(cè)，大大提高檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)血液中10個(gè)CTC的超靈敏檢測(cè)。使用本發(fā)明的方法，避免了使用PCR儀、流式細(xì)胞儀等大型昂貴儀器及耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，有效降低了癌癥病人外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC的檢測(cè)成本，實(shí)現(xiàn)癌癥病人外周血中CTC的微量檢測(cè)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

<110> 福州大學(xué)

<120> 一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物血液中微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性方法

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 89

<212> DNA

<213> EAD

<400> 1

cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctgga atcaatctga 60

atcaatctac gacgtactcc taactagct 89

<210> 2

<211> 79

<212> DNA

<213> DNA1

<400> 2

tagacttagt tagatgctgc tccgcccgtc ccacgtactt tttatgttct ctctcttgcc 60

tctgtcccac gtccgtctc 79

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> DNA2

<400> 3

ggcaagagag agaacataaa tccgcccgtc ccacgtactt atctgaatca atctacgacg 60

tcccacgtcc gtctc 75

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> RCA-primer

<400> 4

agggtgcagg cagag 15

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> MB

<400> 5

gagtcgctcc gcccgtccca cgtactttta aggcgactc 39