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與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽及制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:12054497閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽,其特征在于:所述多肽的氨基酸序列為Thr-Val-Arg-Thr-Ser-Ala-Asp。

2.如權(quán)利要求1所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制備方法,其特征在于:包括以下步驟:(1)靜止型肝星狀細(xì)胞與激活型肝星狀細(xì)胞培養(yǎng);(2)以靜止型肝星狀細(xì)胞為吸附細(xì)胞、激活型肝星狀細(xì)胞為靶細(xì)胞,采用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行差減篩選;(3)經(jīng)DNA測序確定目標(biāo)多肽。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制備方法,其特征在于:所述步驟(2)以靜止型肝星狀細(xì)胞為吸附細(xì)胞、激活型肝星狀細(xì)胞為靶細(xì)胞,采用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行差減篩選,具體為:分別取步驟(1)中培養(yǎng)的生長良好的靜止型肝星狀細(xì)胞以及激活型肝星狀細(xì)胞,在37℃、體積濃度5%的CO2條件下,置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h后,備用;分別在所得靜止型肝星狀細(xì)胞以及激活型肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入BSA,在37℃、50rpm條件下,恒溫培養(yǎng)搖床中封閉;在靜止型肝星狀細(xì)胞中加入噬菌體原始肽庫的稀釋液,在37℃、50rpm條件下恒溫培養(yǎng)搖床中孵育;隨后將與靜止型肝星狀細(xì)胞孵育后的上清液加入封閉后的激活型肝星狀細(xì)胞中,在37℃、50rpm條件下恒溫培養(yǎng)搖床中孵育,棄與激活型肝星狀細(xì)胞孵育后的上清液,用PBST緩沖液洗滌6次,加入pH=2.2的甘氨酸-鹽酸緩沖液,置于37℃、50rpm條件下恒溫培養(yǎng)搖床中洗脫;收集洗脫液,加入pH=9.1的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行中和;測定洗脫液所含噬菌體滴度;隨后取該洗脫液感染宿主菌E.coli ER2738進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增后噬菌體通過離心以及PEG/NaCl沉淀的方法進(jìn)行純化,再次測定擴(kuò)增、純化后噬菌體滴度,完成第一輪篩選;重復(fù)以上步驟數(shù)次,篩選結(jié)束。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制備方法,其特征在于:所述步驟(2)以靜止型肝星狀細(xì)胞為吸附細(xì)胞、激活型肝星狀細(xì)胞為靶細(xì)胞,采用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行差減篩選,具體為:分別取步驟(1)中培養(yǎng)的生長良好的靜止型肝星狀細(xì)胞以及激活型肝星狀細(xì)胞,在37℃、體積濃度5%的CO2條件下,置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h后,備用;分別在所得靜止型肝星狀細(xì)胞以及激活型肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1.5mL質(zhì)量濃度為1%的BSA,在37℃、50rpm條件下,恒溫培養(yǎng)搖床中封閉30min;在靜止型肝星狀細(xì)胞中加入1.5mL滴度為2×1011pfu的噬菌體原始肽庫的稀釋液,在37℃、50rpm條件下恒溫培養(yǎng)搖床中孵育1h;隨后將與靜止型肝星狀細(xì)胞孵育后的上清液加入封閉后的激活型肝星狀細(xì)胞中,在37℃、50rpm條件下恒溫培養(yǎng)搖床中孵育1h,棄與激活型肝星狀細(xì)胞孵育后的上清液,用0.1%~0.3%PBST緩沖液洗滌6次,加入1mL0.2mol/L的pH=2.2的甘氨酸-鹽酸緩沖液,置于37℃、50rpm條件下恒溫培養(yǎng)搖床中洗脫10min;收集洗脫液,加入150μL1mol/L的pH=9.1的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行中和;測定洗脫液所含噬菌體滴度;隨后取0.5mL該洗脫液感染宿主菌E.coli ER2738進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增后噬菌體通過離心以及PEG/NaCl沉淀的方法進(jìn)行純化,再次測定擴(kuò)增、純化后噬菌體滴度,完成第一輪篩選;重復(fù)以上步驟數(shù)次,篩選結(jié)束。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制備方法,其特征在于:所述步驟(2)中共完成3~5輪篩選,所用0.1%~0.3%PBST緩沖液是指含Tween-20體積濃度為0.1%~0.3%的PBS緩沖液。

6.根據(jù)權(quán)利要求3~5任一項所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制備方法,其特征在于:所述步驟(2)中共完成4輪篩選;其中,第一輪篩選中所用0.1%PBST緩沖液為含Tween-20體積濃度為0.1%的PBS緩沖液;第二輪篩選中所用PBST緩沖液為0.2%PBST緩沖液,即含Tween-20體積濃度為0.2%的PBS緩沖液;第三輪和第四輪篩選中所用PBST緩沖液為0.3%PBST緩沖液,即含Tween-20體積濃度為0.3%的PBS緩沖液;第四輪篩選時洗脫液進(jìn)行滴度測定后不再進(jìn)行擴(kuò)增純化。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制備方法,其特征在于:所述步驟(3)經(jīng)DNA測序確定目標(biāo)多肽,具體為:取最后一輪篩選后的洗脫液進(jìn)行噬菌體滴度測定時,選取若干個陽性噬菌體克隆,分別進(jìn)行擴(kuò)增和純化,隨后進(jìn)行DNA測序,選取測序結(jié)果顯示插入序列重復(fù)次數(shù)最多的噬菌體,其所展示的多肽即為目標(biāo)多肽。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制備方法,其特征在于:所述步驟(1)中靜止型肝星狀細(xì)胞是通過以下步驟培養(yǎng):將大鼠麻醉后,采用質(zhì)量濃度為0.05%的Ⅳ膠原酶體外循環(huán)消化以及Opetiprep密度梯度離心的方法,分離大鼠原代肝星狀細(xì)胞,用含20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按3×106接種于6cm培養(yǎng)皿中,置于37℃、體積濃度5%的CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,細(xì)胞貼壁單層長滿皿底,即得靜止型肝星狀細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制備方法,其特征在于:所述步驟(1)中激活型肝星狀細(xì)胞是通過以下步驟培養(yǎng):原代分離的肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)14天后,用質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶常規(guī)消化傳代,用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后接種到新的6cm培養(yǎng)皿中,置于37℃、體積濃度5%的CO2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁單層長滿皿底,即得激活型肝星狀細(xì)胞。

10.如權(quán)利要求1所述的與激活型肝星狀細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽在制備肝纖維化診斷試劑或肝纖維化靶向治療藥物中的應(yīng)用。

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