本發明屬于化合物制備技術領域，具體涉及一種微蛋白指示劑5′，5″-二硝基3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞(didntb)的純化方法。

背景技術：

5′，5″-二硝基3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞(didntb)是一種酚磺酞的衍生物，同時也是尿液分析試紙微蛋白指示劑的重要反應底物，其純度的高低直接影響試紙顯色的靈敏度和顯色范圍。目前該產品還未見國內廠家直接生產，一般都是進口，但國外的廠家也存在產品純度低下的問題。制約產品的技術瓶頸之一就是合成后產品純化的問題，其純化的方法還未見文獻報道。用于合成它的前體化合物3，4，5，6-四溴酚磺酞的純化方法我公司已申請了專利，詳見專利201210068919.5。

合成它的方法一般都是從本公司專利技術純化后的3，4，5，6-四溴酚磺酞經碘代和硝化后制得didntb粗品。該合成路線如下所示：

通過該硝化反應我們發現反應物和產物之間分子量差別不大，極性和酸堿性也差別不大，這樣用傳統的堿溶酸沉的方法很難將他們分開，如果用柱層析的辦法費時費力另外產品損失也大。

因此，這就需要一種工藝簡單、成本低廉、便于生產、毒害性小，低污染的純化方法，能夠充分去除雜質，提高產品純度，確保其使用效果。

技術實現要素：

本發明提供一種微蛋白指示劑的純化方法，以解決用傳統的堿溶酸沉的方法很難將didntb粗品純化，用柱層析的辦法費時費力，產品損失較大的問題。

本發明采取的技術方案是，包括下列步驟：

將didntb粗品溶于含金屬離子的酸性溶劑中，過濾后得濾液，調ph值，用有機溶劑萃取，減壓蒸餾后得絡合分離產物，然后再重結晶，制得最終產物。

所述的金屬離子是ca²⁺、mg²⁺、fe³⁺、或al³⁺中的一種。

所述金屬離子的摩爾濃度0.1-5mol/l。

所述的酸性溶劑指酸性ph值1-5，所用溶劑水、甲醇、乙酸乙酯或正丁醇。

所述的得到的濾液調ph值10-13。

所述的萃取有機溶劑指乙醚或石油醚。

所述的重結晶，是指絡合分離產物與乙醚1:2-6(w/v)混合或與石油醚1:8-15(w/v)混合，超聲10-30min后靜止過濾，濾餅于115度干燥2-3小時，制得最終產物。

通過對比硝化合成反應的前后化合物結構差異發現，硝化反應后產物分別在羥基和羰基兩個臨位上分別引入了一個硝基，這個硝基上的氧原子和臨位羥基和羰基的氧原子就形成了多齒配位原子，易與金屬離子形成分子內配位反應，對ca²⁺、mg²⁺、fe³⁺、al³⁺等金屬離子有很強的螯合力。假如引入al3⁺離子，其反應式如下所示：

這樣絡合al³⁺離子的5′，5″-二硝基3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞要比3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞多六個電荷，這樣極性大大增加，我們可以用相似相容的原理選擇極性溶劑將反應物和產物分開，有些絡合劑的絡合能力在不同ph值變化很大,有的甚至會水解、分解或發生反應而失去絡合力。我們選擇這樣的絡合離子，分開后調整體系酸堿度使絡合解離保證產物結構不被破壞，大大減少因反應不完全而留在產物里的反應物的量，從而提高反應物的純度。通過重結晶進一步提升產物純度。

本發明實驗表明，當didntb粗品遇到含金屬離子的酸性溶劑時didntb就會被絡合從而極性變大溶解出來，而未反應的原料因缺兩個硝化基團不能與金屬離子絡合，極性沒改變不被溶解留在固相中。因此要滿足這個過程的發生，絡合的金屬離子電荷越多對didntb的極性改變越大，一般3價態的鋁離子絡合上兩個之后didntb就是6價態，對didntb極性改變非常大，適合用于絡合的金屬離子。所用溶劑必須是酸性條件下的，因為一般絡合反應的發生必須是酸性體系，同時溶劑必須選擇極性的，這種溶劑不能溶解3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞而能溶解絡合后的didntb，實驗發現水和甲醇效果要高于乙酸乙酯和正丁醇，因為原料3′，3″-二碘-3，4，5，6-四溴酚磺酞在這兩種溶劑中有微量的溶解，影響了產率。而且水成本低，無毒無害，適合于工業化生產。

本發明實驗表明，當調節絡合了金屬離子的didntb濾液ph值時，一般調節到10-13，隨著金屬離子的解離，didntb會部分析出，溶液出現渾濁現象，可忽略這種渾濁，直接加入乙醚或石油醚萃取，didntb會被萃取出來，減壓回收乙醚或石油醚得絡合分離產物。

本發明所述的重結晶步驟中，采用的是非質子非極性的溶劑可以是四氯化碳、乙醚和石油醚，使用乙醚、石油醚與四氯化碳相比，所得產物雜質含量低、純度高、生產成本低、毒害性小、污染小，因此，使用乙醚和石油醚效果較好。同時本實驗采用的是超聲溶解法，溶解比回流溶解的溫度低，保護了didntb結構受熱不穩定的影響。

與已有的堿溶酸沉、柱層析方法比較，本發明的純化方法具有以下優點：

1)本發明的純化方法工藝簡單、成本低廉、便于生產，而且不使用苯和四氯化碳等一類溶劑，毒害性小，所用有機溶劑均能回收，環境污染低，產品純度能達到95％以上。

2)本發明的純化方法，先后使用了絡合分離和重結晶兩種方法，即先在絡合分離中有效的去除了因反應不完全殘留的原料雜質，然后在重結晶步驟中使一些溶劑殘留保留在結晶母液中。這樣制得的產物幾乎不包含原料藥、有機溶劑殘留，從而大幅度提高了產品純度(95％以上)。

按照本發明所述方法實施，最終制得的didntb雜質低、純度高。因此本發明的純化方法能夠確保didntb的質量。

本發明所述的純化方法不僅可以制備純度較高的didntb，也可用于市售的didntb的純化，該方法能夠克服現有技術的不足。另外對于具有相似結構的化合物也可開發這種分離方法。

具體實施方式

本發明中所述的純度，其分析方法均采用rp-hplc方法進行分析，用面積歸一化法計算，該方法可具體應用如下色譜條件進行：

檢測波長：254nm；色譜柱：c18柱(5μm,4.6×250mm)；流動相：含0.1％tfa的乙腈-水(40：60)溶液；柱溫30℃；流速：1ml/分鐘。

下面結合實施例，對本發明一種didntb的純化方法做進一步說明，但本發明的保護范圍并不限于實施例。

實施例1didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為0.5mol/lal³⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值1，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值10，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品15g，純度91％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:10(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.5g，純度95.7％。

實施例2didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為0.8mol/lal³⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值1，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值10，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品14.8g，純度92％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:8(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.6g，純度96.6％。

實施例3didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為2mol/lal³⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值1，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值10，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品13g，純度90％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:6(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.2g，純度94.3％。

實施例4didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為4mol/lal³⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值2，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值10，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品16g，純度92％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:12(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.8g，純度95.8％。

實施例5didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為5mol/lal³⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值2，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值10，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品15g，純度92％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:15(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.5g，純度95.8％。

實施例6didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為0.8mol/lal³⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值4，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值12，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品15g，純度90％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:15(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.5g，純度94.8％。

實施例7didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為0.5mol/lal³⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值5，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值13，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品16g，純度92％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:10(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.2g，純度95.4％。

實施例8didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為0.5mol/lal³⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值4，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值13，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品14.8g，純度92％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:10(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.7g，純度95.6％。

實施例9didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為0.5mol/lzn²⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值1，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值10，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品14g，純度85％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:10(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.3g，純度90.1％。

實施例10didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為0.8mol/lzn²⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值1，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值13，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品16g，純度92％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:8(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.4g，純度96.6％。

實施例11didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為2mol/lzn²⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值3，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值14，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品14.5g，純度86％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:6(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.2g，純度92.3％。

實施例12didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為0.5mol/lzn²⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值5，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值10，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品16.2g，純度84％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:14(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.4g，純度90.3％。

實施例13didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為2mol/lzn²⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值2，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值14，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品16g，純度87％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:10(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.6g，純度92.2％。

實施例14didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為3mol/lzn²⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值4，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值13，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品15g，純度82％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:10(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.5g，純度90.6％。

實施例15didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為4mol/lzn²⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值2，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值13，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品15g，純度86％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:10(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.5g，純度91％。

實施例16didntb粗品的純化

將20gdidntb粗品溶于含摩爾濃度為5mol/lzn²⁺離子的1000ml酸性水中，體系ph值2，過濾后得濾液，用氫氧化鈉調ph值10，1000無水乙醚萃取，減壓蒸餾乙醚得didntb絡合分離產品14.5g，純度84％；

取絡合分離產品10g，與無水乙醚按1:9(w/v)混合，超聲攪拌20min，過濾，濾餅于115度干燥2小時，制得最終產物7.6g，純度90.5％。