本發明涉及殺菌領域，尤其涉及一種功能化殺菌微球及其制備方法和應用。

背景技術：

目前常用的飲用水及飲料常用的殺菌方法分別為：熱殺菌和非熱殺菌。其中，熱殺菌主要有：濕熱殺菌、干熱殺菌、微波殺菌、電熱殺菌和電場殺菌等；非熱殺菌主要有：化學與生物殺菌、輻照殺菌、紫外線殺菌、脈沖殺菌、超高靜壓殺菌、脈沖電場(pef)殺菌以及振動磁場殺菌等。熱殺菌又可分為高熱殺菌和低熱殺菌。高熱殺菌是利用高溫使微生物蛋白質變性以達到殺菌的目的。雖然高熱殺菌的殺菌速度較快，殺菌也較為徹底，但往往會破壞液體飲料的營養及品質。低熱殺菌最常見的是巴氏殺菌，也是目前最常用的液體食品殺菌技術，簡單方便。但其設備較為龐大，而且相比常溫殺菌還是需要較多的能耗。化學殺菌是非熱殺菌中最常見的方法，也是目前飲用水殺菌的常規方法，其多利用氧化型殺菌劑產生的次氯酸、原子態氧等，使微生物體內一些與代謝有密切關系的酶發生氧化作用而殺滅微生物。但氧化性殺菌劑有它不可克服的缺點：當水源中有機物含量稍高，氯氣殺菌將產生氯代有機物，可致癌；穩定性欠佳，易分解，運輸貯藏成本高，并存在爆炸等潛在威脅。如果能開發一種價格經濟、使用簡單、高效、安全的新型殺菌劑，不破壞營養成分的同時，無有害物質殘留，而且無需過多專業知識即會使用，非但能改善現做飲料的衛生狀況，還可以提高罐裝水和飲料的安全，成為提高水質的關鍵技術之一。

技術實現要素：

本發明提供一種功能化殺菌微球及其制備方法和應用，用來解決現有技術中可溶性殺菌劑殘留水體的問題。

為了解決上述技術問題，本發明提供以下技術方案：

(1)將氯球置于反應溶劑dmf中，直至氯球充分溶漲；

(2)在步驟(1)的所得物中加入5-巰基-1-甲基四唑和一定量催化劑金屬鈉，在氮氣保護條件下，保持85-95℃溫度攪拌反應11-13小時；

(3)過濾步驟(2)的所得物，得到微球，用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌后，過濾微球置于50℃下真空干燥；

(4)在氮氣保護條件下，將步驟(3)的所得物置于環氧丙烷中，其中氯球與環氧丙烷的質量體積比為2mg：0.5-1.5ml，于18-22℃下攪拌反應5-8小時，再加入芐氯，氯球與芐氯的質量體積比為1mg∶1-1.5ml。在常溫下攪拌反應5-8小時后濾出，用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球。

其反應路線如下：

步驟(1)中，所述氯球與反應溶劑dmf的質量體積比為3mg：1-3ml。

步驟(2)中，5-巰基-1-甲基四唑與氯球的摩爾比為2-5:1，催化劑金屬鈉加入量為氯球加入量的5％。

本發明的殺菌微球在飲用水或飲料殺菌中的應用。能有效地殺滅飲用水中的微生物，避免水溶性殺菌劑帶來的“二次污染”和水體殘留問題。

本發明中所用的氯球是交聯度為8％dvb，含氮量19.15％，比表面43m²·g^‐1的大孔型交聯氯甲基化聚苯乙烯珠體，購于南開大學化工廠，是一種極易改性修飾的高分子樹脂。

本發明相對于現有技術，具有以下優點：

1.本發明所用的原材料是一種極易改性修飾的樹脂氯球，它有較高的機械強度和物理穩定性，具有耐溶脹，耐氧化，耐磨損，耐溫度變化，不易碎裂，再生方便等優點，來源廣泛，價格低廉，同時由于其有較高的化學反應活性基團氯甲基(–ch2cl)，能固定更多不同類型的殺菌功能基，性能穩定，固載量大，殺菌效果也能夠更高。本發明創造性地選用多元含氮雜環作為氯球固載的功能基因子，屬雜環季銨鹽。與目前常見的長鏈季銨鹽殺菌劑相比，不僅具有功能基不易從母體上脫落，不會造成殺菌劑失效和“二次污染”的優點，而且還可以有效地克服直鏈季銨鹽長期使用后會產生抗性影響其性能的缺點，具有明顯的經濟效益。

2.本發明提供的新型固定化殺菌劑的反應路線簡單，合成方法操作方便，只需要母體接枝功能基試劑和接枝后季銨化兩步反應即可完成，條件容易實現，兩步反應只需要在85-95℃和室溫下在三頸瓶中進行即可，無需大型儀器設備，所以容易實現批量生產及自動化控制，具有良好的應用前景。

3.本發明提供的新型殺菌微球主要有以下三點性能優勢：1)作用時間短，殺菌效率高，實際自來水殺菌應用中可在1小時之內達到100％殺菌，且在殺菌過程中具有持續時間久，基團不易從載體中脫落，投放量少等優點，比小分子殺菌劑有更好的殺菌性能；2)殺菌微球較難進入動植物體內，可以有效避免由殺菌劑本身造成的“二次污染”；3)本發明提供的殺菌微球是水不溶性的，可有效克服可溶性殺菌劑殘留水體的問題，且微球可回收，可重復使用，能夠提高資源的利用率。

附圖說明

圖1是微球合成裝置搭建示意圖；

圖2所示為氯球、mmt、mmtr的紅外光譜圖；

圖3所示為不同轉化率的mmtr對大腸桿菌的殺菌率的對比圖；

圖4所示為不同轉換率的mmtr對金黃色葡萄球菌的殺菌率的對比圖；

圖5所示為濃度為mbc的mmtr重復使用對大腸桿菌的殺菌率的對比圖；

圖6所示為濃度為mbc的mmtr重復使用對金黃色葡萄球菌的殺菌率的對比圖；

圖7所示為濃度為mbc的mmtr在自來水中殺菌率變化曲線；

圖1中，1-三頸瓶，2-冷凝管，3-攪拌棒，4-溫度計，5-氮氣管道。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

實施例1

量取40ml反應溶劑至容積為100ml的三頸燒瓶中，并加入60.0mg母體(氯球)浸泡過夜。母體充分溶脹后，向三頸燒瓶內加入一定摩爾比的5-巰基-1-甲基四唑和催化劑金屬鈉，在一定的溫度下攪拌反應，并且反應全程通氮氣保護。反應12h后，將三頸燒瓶內微球濾出，然后用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌數次后，過濾微球置于50℃下真空干燥備用。

合成微球的季銨化：將按上述過程的所得物放入250ml的三頸燒瓶內，用氮氣將瓶內空氣排盡后加入30ml的環氧丙烷，20℃下攪拌反應6h后，留向瓶內加入75ml的芐氯，常溫下攪拌反應6h后濾出，并用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌數次至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球(以下簡稱mmtr)。

本發明用傅里葉紅外光譜儀對所合成的新化合物mmtr進行了結構表征：如圖2所示，原來氯球中676cm^-1、1265cm^-1的c-cl強吸收峰消失，說明季銨化時，主要為氯芐基發生了反應。配體5-巰基1-甲基四唑的圖譜中2597cm^-1處-sh特征峰消失，說明其發生了反應，而在新化合物mmtr中出現了842-1176cm^-1譜帶可能為s-c伸縮振動峰，說明功能基試劑與載體通過巰基與氯球的氯芐基進行接枝反應。而且配體中1047-1521cm^-1的四唑譜帶減弱，新化合物mmtr中出現了為1405-1629cm^-1譜帶，表明了芳雜環的存在；而且增加了1679cm^-1處c＝n伸縮振動吸收峰，1311cm^-1處c-n的伸縮振動峰，表明功能基試劑已經成功接枝于載體。

通過以上分析可推斷出本發明制備的功能化殺菌微球，其結構式如下：

實施例2

(1)將氯球置于反應溶劑dmf中，直至氯球充分溶漲；步驟(1)中，所述氯球與反應溶劑的質量體積比為3mg：2ml。

(2)在步驟(1)的所得物中加入5-巰基-1-甲基四唑和一定量催化劑金屬鈉，在氮氣保護條件下，保持90℃溫度攪拌反應12小時，其中，5-巰基-1-甲基四唑與氯球的摩爾比為2～5:1；

(3)過濾步驟(2)的所得物，得到微球，用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌后，過濾微球置于50℃下真空干燥；

(4)在氮氣保護條件下，將步驟(3)的所得物置于環氧丙烷中，其中氯球與環氧丙烷的質量體積比為2mg：1ml，于20℃下攪拌反應6小時，再加入芐氯，氯球與芐氯的質量體積比為1mg∶1.25ml。在常溫下攪拌反應6小時后濾出，用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球。

實施例3

本發明的殺菌微球的制備方法，包括以下步驟：

(1)將氯球置于反應溶劑dmf中，直至氯球充分溶漲；所述氯球與反應溶劑dmf的質量體積比為3mg：1ml。

(2)在步驟(1)的所得物中加入5-巰基-1-甲基四唑和一定量的催化劑金屬鈉，在氮氣保護條件下，保持85℃溫度攪拌反應13小時；5-巰基-1-甲基四唑與氯球的摩爾比為2:1。

(3)過濾步驟(2)的所得物，得到微球，用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌后，過濾微球置于50℃下真空干燥；

(4)在氮氣保護條件下，將步驟(3)的所得物置于環氧丙烷中，其中氯球與環氧丙烷的質量體積比為2mg：0.5ml，于18℃下攪拌反應8小時，再加入芐氯，氯球與芐氯的質量體積比為1mg∶1ml。在常溫下攪拌反應5小時后濾出，用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球。

實施例4

本發明的殺菌微球的制備方法，包括以下步驟：

(1)將氯球置于反應溶劑dmf中，直至氯球充分溶漲；步驟(1)中，所述氯球與反應溶劑dmf的質量體積比為3mg：1-3ml。

(2)在步驟(1)的所得物中加入5-巰基-1-甲基四唑和一定量的催化劑金屬鈉，在氮氣保護條件下，保持95℃溫度攪拌反應11小時；步驟(2)中，5-巰基-1-甲基四唑與氯球的摩爾比為2-5:1。

(3)過濾步驟(2)的所得物，得到微球，用反應溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌后，過濾微球置于50℃下真空干燥；

(4)在氮氣保護條件下，將步驟(3)的所得物置于環氧丙烷中，其中氯球與環氧丙烷的質量體積比為2mg：1.5ml，于22℃下攪拌反應5小時，再加入芐氯，氯球與芐氯的質量體積比為1mg∶1.5ml。在常溫下攪拌反應8小時后濾出，用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌至表面無環氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球。

對比例1

將實施例1中的反應溶劑、反應溫度、攪拌轉速及反應摩爾比根據下表對應組合進行對比實驗，從而獲得不同轉化率的mmtr。

表1不同轉化率的mmtr合成條件

由表1可知，mmtr的最佳反應條件為：反應溶劑為dmf，反應溫度為90℃，母體與配體的反應摩爾比為1∶5，mmtr的轉化率為91.3％。

對比例2

將實施例一中的反應溶劑改為甲苯或水，其余按實施例一操作，得到以下結果：

表2不同反應試劑對mmtr轉化率的影響

由表2可得：在dmf作反應溶劑時，mmtr的含氮量含硫量最高，因此，mmtr的最佳反應溶劑為dmf。

對比例3

將實施例一的配體5-巰基-1-甲基四唑(mmt)改為3-氨基-5-巰基-1,2,4-三氮唑(att)，腺嘌呤(at)，其余按實施例一操作，得到以下結果：

表3不同配體的轉化率

由表3可得：mmt作配體時，殺菌微球的合成率最高。

實驗1:殺菌實驗

本實驗以革蘭氏陰性代表細菌大腸桿菌(e.coli)cicc21524和革蘭氏陽性代表細菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)cicc10384作為受試菌，這兩種菌種均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。具體實驗操作步驟及評價方法如下：

所有菌株均作為儲備培養物輔以15％(v/v)甘油的營養肉體培養基中，保持于-20℃儲存。菌株置于在lb培養基內，37℃恒溫振蕩器中培養18小時；活化后用移液槍取出一定量菌液，在4000rmp下離心洗滌。將所得菌斑用0.85％的生理鹽水通過十倍稀釋法稀釋成濃度約為10⁶cfu/ml的菌懸液備用。

殺菌活性測試

取若干無菌的100ml搖瓶，加入50ml上述制備的菌懸液；在樣品組中加入一定量充分溶脹的殺菌微球mmtr、attr、atr，對照組不加入殺菌微球；振蕩各混合液，接觸不同時間后，根據gb/t4789.3-2010提供的方法，將不同接觸時間上清液分別逐級稀釋，稀釋至適宜濃度后用玻璃涂布棒涂勻，倒置平板于37℃下培養進行平板活菌計數。通過以下公式計算微球殺菌率：

為提高殺菌率的準確性，殺菌率由同一時間點對照組和樣品組取樣進行平板計數后結果根據公式計算得到。

表4所示為殺菌微球mmtr、attr、atr對e.coli,s.aureus的最低殺菌濃度(mbc)，其中，殺菌時間均為3小時，atr為以腺嘌呤為功能基試劑得到的殺菌微球，attr為以3-氨基-5-巰基-1,2,4-三氮唑為功能基試劑得到的殺菌微球。

表4殺菌微球mmtr、attr、atr對e.coli,s.aureus的最低殺菌濃度(mbc)

由表4可知，atr對兩種受試菌均無殺滅效果，而attr對兩種受試菌的殺菌效果不及mmtr。

此外，圖3所示為不同轉化率的mmtr對大腸桿菌的殺菌率的對比圖；圖4所示為不同轉換率的mmtr對金黃色葡萄球菌的殺菌率的對比圖。由圖3可知，mmtr的轉化率越高，大腸桿菌的殺菌率越高；由圖4可知，mmtr的轉化率越高，金黃色葡萄球菌的殺菌率越高。

實驗2：殺菌微球的重復使用

將殺菌后的微球過濾晾干，置于搖瓶中，加入hcl與etoh以1:8(v/v)的混合溶液30ml，振蕩2.5h后，用蒸餾水和生理鹽水沖洗3～5遍后重新用于殺菌，殺菌時間與再生前相同，為3h。

圖5所示為濃度為mbc的mmtr重復使用對大腸桿菌的殺菌率的對比圖；圖6所示為濃度為mbc的mmtr重復使用對金黃色葡萄球菌的殺菌率的對比圖。由圖5及圖6可知，本發明較佳實施例提供的殺菌微球的重復使用后對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌率影響不大。換言之，本發明較佳實施例提供的殺菌微球的重復使用效果好。

實驗3：mmtr在自來水中的實際應用

自取的自來水經過平板計數法測定，其中菌落總數約為85cfu·ml^-1，符合城市自來水的國家標準(gb5749-2006)。取若干無菌的100ml搖瓶，加入50.0ml的自來水；樣品組中加入一定量充分溶脹的殺菌微球，對照組不加入殺菌微球；振蕩各混合液，接觸不同時間后，將不同接觸時間上清液分別逐級稀釋，進行平板活菌計數。仍然以公式計算殺菌率。

通過上述實驗測得mmtr作用于自來水時的最低殺菌濃度(mbc)為0.3mg·ml^-1,由圖7中mmtr在自來水中殺菌率與時間的關系曲線可以顯示殺菌微球可在250min后將自來水的菌全部殺死，雖然自來水中總菌數不多，但自來水中含有許多無機鹽、金屬離子或其他小分子物質。金屬離子及部分無機離子可能易被mmtr的含氮雜環吸附，證明其具有良好的廣譜抗菌性和應用前景。

上述實施例不以任何方式限制本發明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術方案均落在本發明的保護范圍內。