本發明涉及生物可降解高分子領域，特別涉及一種生物可降解超分子聚乳酸微球的制備方法。

背景技術：

納米顆粒或微球作為一種藥物載體材料，在藥物的控制釋放領域得到了廣泛的研究和應用。微球載體能夠克服現有藥物制劑的一些弊端，利用自身的微小粒徑和藥物的高度分散，改善難溶性藥物的水溶性和溶出速率，提高藥物的生物利用率。

制備聚合物微納米顆粒或微球的傳統方法有噴霧干燥、乳液溶劑揮發和凝聚的方法，這些方法存在明顯的不足之處，例如有毒溶劑或助劑的使用難以從微球中完全去除，影響微球的生物相容性，難以調控微球的尺寸和尺寸分布等。為了克服傳統方法的不足，文獻上已報導采用沉淀和溶劑揮發的方法來制備生物可降解的聚合物微納米微球。據文獻(Chen X等，Biomacromolecules 2005,6,2843-2850)報導，將立構多嵌段的聚乳酸(PLA)溶解在良溶劑中，然后再在非溶劑中置換，制備了花型和圓盤形的聚合物顆粒，顆粒的粒徑分布較均勻，在幾十納米到幾微米之間。論文(Zhou Z等，Macromol.Mater.Eng.2016,301,274-278)通過改變溶劑的類型、聚合物溶液的濃度和干燥方法，制備了花瓣形的PLA納米片，該方法可很好調控材料的孔隙率和機械性能。

PLA可基于生物質資源制備，具有許多優異的性能，比如生物可降解性、生物相容性和環境友好性。由于PLA的單體具有旋光異構性，故PLA有兩種對映異構體，即聚左旋乳酸(PLLA)和聚右旋乳酸(PDLA)，其中PLLA更為常見。PLLA的熔點為170℃，結晶速率較慢。當PLLA和PDLA共混時，可形成立構復合結晶，熔點高達230℃，比單獨的PLLA或PDLA的同質結晶高約50℃。此外，對PLA末端官能化能調控聚合物的結晶，從而改善聚合物的熱性能和形貌。論文(Biela T等，Macromolecules 2015,48,2994-3004)在PLA的末端用2-脲基-4[1H]-嘧啶酮(UPy)或尿嘧啶修飾，將PLLA和PDLA等比例共混，用N-甲基吡咯烷酮溶解，甲醇沉淀，制備了球形顆粒。當利用UPy雙端修飾時，用三氯甲烷溶解，甲醇沉淀，得到纖維狀的形貌結構。因此，將PLA的立構復合結晶和端基修飾結合，可以得到不同結構和性能的微納米材料。

但是，大多數傳統沉淀和溶劑揮發的方法只能得到球形顆粒。在制備載藥微球時，傳統制備方法需要加入乳化劑。論文(Teng等，J.Appl.Polym.Sci.2015,132,42213-42219)在制備裝載利福平藥物的星型聚乳酸微球時，加入了2.5％的聚乙烯醇作為乳化劑，最終通過沉淀和洗滌的方法移除聚乙烯醇乳化劑。論文(Zhang等，Polym.Bull.2012,68,27-36)在制備牛血清蛋白裝載的星型聚(乙交酯-co-丙交酯)無規共聚物微球時，也用聚乙烯醇作為乳化劑。但是乳化劑的使用使得難以從微球中完全去除，從而限制了生物可降解顆粒的廣泛應用。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種生物可降解超分子聚乳酸微球的制備方法。

為解決上述技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種生物可降解超分子聚乳酸微球的制備方法，是將2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修飾的聚乳酸溶解于良溶劑中，在攪拌條件下逐滴加入不良溶劑；持續攪拌24小時后，離心洗滌、收集固體沉淀；真空干燥后，得到生物可降解超分子聚乳酸微球；所述良溶劑是二氯甲烷、氯仿或四氫呋喃中的任意一種；不良溶劑是乙醇或甲醇。

本發明中，將2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修飾的聚乳酸溶解于良溶劑中時，使聚乳酸溶液的濃度為1mg/mL。

本發明中，所述不良溶劑在溶劑總用量中所占的體積分數為20％～90％。

本發明中，所述干燥是指在60℃下干燥6h。

本發明中，所述2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修飾的聚乳酸的分子形式呈線性或三臂星形，其具體結構式為：

線性聚乳酸：

三臂星形聚乳酸：

上述式中，

其中，n為40～890。

本發明中，所述聚乳酸的分子量在3～64kDa之間，是聚左旋乳酸、聚右旋乳酸或者兩者的混合物。

發明原理描述：

在溶劑置換中，結晶可以誘導不同微納米組裝結構的形成，微納米組裝體的結構與成核形式、結晶速率、結晶結構有關。PLA有兩種結晶形式，兩種結晶的比例可通過混合比例調控，所以可利用兩種結晶形式不同的成核速率、結晶增長速率、鏈堆積形式制備不同形貌的生物可降解顆粒。另外，當鏈段中引入可形成非共價鍵的超分子基團時，可增加鏈間相互作用力和鏈纏結程度，從而改變溶液結晶中自組裝顆粒的大小和形貌。

本發明通過沉淀和溶劑揮發的方法制備PLA微球，在溶劑置換的過程中，通過液液相分離和聚合物結晶相結合的方式，可以得到不同形貌的聚乳酸微球，而且，通過控制不同立體異構聚乳酸的共混，可以實現不同形貌的微球之間的轉變，顯著區別于傳統沉淀和溶劑揮發制備方法所能得到的球形顆粒。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

(1)本發明所述的PLA微球采用沉淀和溶劑揮發的方法制備，簡單易行，可實施性高。

(2)本發明利用液液相分離和聚合物結晶相結合的方法來調控聚合物微球的形貌，同時調控其結構與性能，擴大應用范圍。

(3)本發明采用UPy的四重氫鍵來構筑超分子聚合物，四重氫鍵作用力強，調控不同鏈拓撲結構PLA的鏈纏結程度，從而得到不同形貌的PLA微球。

(3)本發明所制備的材料的原料均來自生物質可再生資源，使用后可完全降解，綠色環保，同時具有良好的生物相容性。

(4)本發明采用藥物和聚合物共沉淀的方法制備載藥顆粒，可以有效的避免乳化劑使用，從而使得聚合物納米顆粒或微球具有更為廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1為實施例2制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖2為實施例3制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖3為實施例8制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖4為實施例9制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖5為對比例1制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖6為對比例2制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖7為實施例2、3和對比例1超分子PLA顆粒在磷酸緩沖液中的載藥釋放曲線。

具體實施方式

下面結合附圖與具體實施方式對本發明作進一步詳細描述。下面的實施例可以使本專業的技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。

本發明制備所使用試劑與藥品如下：L-丙交酯和D-丙交酯購自普拉克公司；L-丙交酯和D-丙交酯在乙酸乙酯中重結晶純化，備用；1,6-己二醇、三羥甲基丙烷和辛酸亞錫購自Sigma-Aldrich公司；1,6-二異氰酸酯購自萬華化學公司；2-氨基-4-羥基-6-甲基嘧啶和氮甲基吡咯烷酮購自J&K公司。

本發明所述異氰酸根末端官能化的2-脲基-4[1H]嘧啶酮(UPy-NCO)的結構式為：

參照文獻(Meijer E W等，Science 1997,278,1601-1604)方法制備，具體步驟如下：將2-氨基-4-羥基-6-甲基嘧啶(10.0g)加入至500ml三口燒瓶中，65℃下抽真空0.5h，充氬氣保護，加入95.0g六亞甲基二異氰酸酯和3.2g氮甲基吡咯烷酮為催化劑，其中HDI摩爾數為2-氨基-4-羥基-6-甲基嘧啶摩爾數的7倍，催化劑含量為總反應物質量的3％。100℃下反應16h后，將產物溶于三氯甲烷中，滴入體積比為6:1的正庚烷與異丙醚的混合液中(共700ml)，沉淀，過濾。將白色固體產物置于50℃真空烘箱中干燥10h，備用。

羥基末端官能化的線性和三臂星形PLLA和PDLA參照文獻(Pan P等，Cryst.GrowthDes.2016,16,1502-1511)方法制備，設計分子量為8kg/mol的三端羥基封端的三臂星形PLLA的具體制備步驟如下：將20g L-丙交酯、0.335g三羥甲基丙烷和0.12g辛酸亞錫干燥后加入燒瓶中，氬氣保護，在130℃條件下反應5h，得到PLLA產品。將得到的粗產物于三氯甲烷中溶解，在無水乙醚和正己烷等體積混合的沉淀劑中沉淀除去未反應的丙交酯，過濾，干燥得到聚合物。通過改變引發劑與丙交酯的質量比，制備了具有不同分子量的聚合物。聚合物的分子量由核磁共振氫譜測定。本發明所使用雙端羥基封端的線性和三端羥基封端的三臂星形PLLA、PDLA的制備條件與分子量列于表1。表1：雙端羥基封端的線性和三端羥基封端的三臂星形PLLA、PDLA的制備條件與分子量

注：聚合物名稱中，2L、2D、3L、3D分別代表雙端羥基封端的線性PLLA、PDLA及三端羥基封端的三臂星形PLLA、PDLA，后綴數字表示聚合物從核磁所計算的分子量。

1)UPy端官能化PLLA和PDLA的制備

參照(Pan P等，Cryst.Growth Des.2016,16,1502-1511)方法，進一步制備了UPy端基官能化的線性和三臂星形的PLLA和PDLA，具體方法為：將羥基末端官能化的線性或三臂星形PLLA或PDLA、異氰酸根末端官能化的UPy-NCO、辛酸亞錫和甲苯置于希丁克管中，氬氣保護下，在110℃反應12小時；反應結束后利用旋轉蒸發儀除去有機溶劑，然后加入至二氯甲烷中溶解，過濾。在室溫下使溶劑揮發，得到的固體物質即為UPy端官能化的PLLA或PDLA。其中，UPy-NCO的摩爾量是羥基末端官能化的線性或三臂星形PLA的3倍，辛酸亞錫占總質量的0.6％，甲苯質量為PLLA或PDLA質量的30倍。

NMR測試：利用核磁共振(Bruker公司，400MHz)測試聚合物的¹H NMR譜圖，進而計算其數均分子量(M_n)。測試溫度為室溫，溶劑為氘代氯仿，化學位移(δ)由溶劑峰校正。分子量計算說明：對于PLA，通過比較端羥基相鄰的叔碳上的氫(δ＝4.3ppm)與主鏈中叔碳上的氫(δ＝5.1ppm)的峰面積比計算聚合度和分子量。

2)超分子PLA微球的制備

實施例1～9

在實施例1～9中，將UPy端基官能化的線性或三臂星形PLLA、PDLA按一定質量比溶于二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃等良溶劑中，使聚合物溶液的濃度為1mg/mL。攪拌混合2h后，逐滴加入乙醇、甲醇等不良溶劑中，攪拌，不良溶劑所占的體積分數為20％～90％，4h后滴完。然后攪拌24h后，離心洗滌，收集固體沉淀。將固體沉淀60℃下真空干燥6h后，得到生物可降解的超分子PLA微球。

在對比例1和2中，以羥基末端官能化的線性或三臂星形PLLA、PDLA或兩者的混合物為原料，利用相同的方法制備PLA顆粒。實施例1～9和對比例1～2中PLLA、PDLA配比、溶劑中不良溶劑所占體積分數列于表2中。

形貌表征：采用場發射掃描電子顯微鏡(FESEM)表征。將干燥的聚乳酸顆粒粘附在導電碳膠上使用CorlzeisD Utral55型FESEM以5keV加速電壓進行觀察。

PLA顆粒的載藥和藥物緩釋實驗以抗癌藥物利福平為例，將10mg的利福平、100mg的UPy端基官能化的PLLA、PDLA混合物共同溶解于二氯甲烷中，聚合物的初始濃度為1mg/mL；2h后，逐滴加入無水乙醇，攪拌；乙醇所占的體積分數為70％，4h后滴完。攪拌24h后，離心、洗滌，干燥后，得到生物可降解的聚乳酸載藥顆粒。

取2.5mg的PLA載藥顆粒溶于10mL的N，N-二甲基甲酰胺溶劑中，用紫外-可見光分光光度計測定溶液在340nm波長處的吸光度，基于標準曲線計算顆粒的載藥量。

PLA顆粒的酶降解實驗：將2.0mg蛋白酶K、1.0mg疊氮化鈉和一定量用濾紙包好的PLA顆粒加入至10mL磷酸緩沖溶液(pH＝7.4,50mM)中，然后置于37℃的恒溫搖床上使其緩慢降解，一定的時間間隔后，將PLA顆粒冷凍干燥，根據PLA顆粒的重量損失，從而計算降解率。

熱性能測試：使用DSC測試，氮氣氣氛。樣品以10℃/min從室溫升溫至180℃或者230℃。熱性能參數的計算方法如下：120℃至160℃間的吸熱峰為PLLA、PDLA同質結晶的熔融峰，峰值溫度為同質結晶的熔點，積分面積為同質結晶熔融焓(ΔH_m,hc)。180℃至220℃間吸熱峰為PLLA/PDLA立體復合結晶的熔融峰，積分面積為立體復合結晶焓(ΔH_m,sc)。立體復合結晶的相對分數(f_SC)由公式f_SC＝ΔH_m,sc/(ΔH_m,sc+ΔH_m,hc)計算得到。

表2為實施例1～9和對比例1～2中PLA顆粒的制備條件、形貌、粒徑、載藥量、降解率和熱性能參數。

表2：實施例1～9和對比例1～2中PLA顆粒的制備條件、形貌、粒徑、載藥量、降解率和熱性能參數

由表2和圖1可知，在實施例2中，超分子PLA顆粒為花瓣形形貌。而對比例1中的顆粒形貌不規整，說明超分子基團的存在可促進鏈纏結，從而形成蓬松的花瓣型結構。實施例4也不能形成花瓣形結構，主要是由于線形PLA的鏈纏結密度沒有三臂星形PLA鏈纏結密度高。當PLLA和PDLA的共混質量比為50/50時(如實施例3、5和對比例2)，均呈現出球形特征，主要是由于立體復合結晶的形成導致結晶速率加快，鏈堆積緊密，降低液液微相分離的尺寸，從而形成尺寸較小的球形顆粒。對比實施例1、2、6，改變良溶劑和劣溶劑的類型以及良溶劑所占的體積分數，均能得到花瓣形結構，表明良溶劑和劣溶劑的不同選擇不會影響顆粒的形成。

對比實施例3和對比例2，由圖1可知，實施例3的球形粒子尺寸較大，表面光滑度降低，主要是UPy超分子端基的存在增大了鏈纏結，容易形成較大的顆粒。實施例4表現為片狀結構，不能形成花瓣形結構。實施例6的形貌特征表明高分子量的PLA也能形成花瓣形結構，但實施例7的結果表明高分子量的PLLA和PDLA等質量共混時，不能形成球形粒子。

由表2可知，實施例8、9中改變了超分子PLLA和PDLA的共混比例，對比實施例2、8、9可知，通過改變超分子PLLA和PDLA的混合比例，可以實現聚合物顆粒從花瓣形到球形形貌的轉變。說明立構復合結晶作用的增強，分子鏈的堆積更為緊密，同時結晶速率加快，更易形成球形顆粒。

PLA顆粒對包裹在顆粒內的藥物具有緩釋效果。取2mg載藥PLA顆粒分散在5mLPBS緩沖溶液(pH＝7.4，50mM)中，待溶液分散均勻，將溶液轉移至透析袋中(截留分子量為3500)，對10mL PBS緩沖溶液(pH＝7.4，50mM)進行透析。透析袋外的緩沖溶液經一定的時間間隔進行更換，同時利用紫外分光光度計測試緩沖溶液中的利福平濃度，進而計算累計釋放量。圖2為實施例2～3和對比例1中PLA載藥顆粒的藥物釋放曲線。由圖2可知，對比實施例2、3的結果，隨著PLLA和PDLA共混比例趨向于50/50時，立構復合結晶的含量升高，聚合物和藥物分子之間的作用增強，鏈堆積更為緊密，所以PLA顆粒的藥物裝載量逐漸增大，釋放的速率逐漸減慢。同時表3也說明了這一結果，對比實施例2、3、8、9可知，隨著PLLA和PDLA共混比例趨向于1/1時，PLA顆粒的藥物裝載量從0.34％增加至4.11％，降解率從41％降至25％。因此，UPy端基官能化的線性或三臂星形PLA顆粒可用作藥物釋放的載體，并且通過調控PLA的端基修飾和PLA的結晶形式控制載藥顆粒的釋放行為。

最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容中直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。