本發明屬于醫學免疫學和感染病學領域，涉及多種乙型肝炎病毒的抗原表位肽序列。
背景技術：
乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)感染是最常見感染性疾病之一，嚴重危及人類的健康。世界衛生組織2015年7月統計數據顯示，預計全球1/3的人口感染過hbv，約2.48億hbv攜帶者，后期可發展為肝硬化和原發性肝細胞癌。每年約78萬hbv感染的患者因疾病進展為肝硬化、肝衰竭或是肝癌而導致死亡。流行病學調查顯示在中國大陸地區約8億人感染過hbv，乙肝表面抗原(hepatitisbsurfaceantigen,hbsag)攜帶率高達10.34％，即我國目前約有1.2億人為hbv攜帶者，占全球慢性感染人數的一半。另外，我國也是一個肝癌大國，約占全球肝癌人數的55％以上。
hbv基因組由不完全雙鏈環狀dna組成，長的為負鏈，含3020-3320個堿基，短的為正鏈，含1700-2800個堿基。包括四個開放閱讀框(orf)，分別稱為c、x、p和s編碼區。c區由pre-c和c基因組成，分別由不同的起始密碼子調控，在相同的終止密碼子處結束，pre-c和c基因共同編碼pre-c蛋白，pre-c蛋白再經過切割加工后形成核心抗原(hbeag)。s區由s基因、pres1和pres2基因組成，由3個不同的起始密碼子啟動翻譯，在同一個終止密碼子處終止翻譯，分別編碼表面抗原(hbsag)蛋白、pres1蛋白和pres2蛋白。p區基因編碼的hbv的聚合酶蛋白(hbpol)。x區的基因編碼x蛋白(hbx)，包含154個氨基酸，是最小的一個開放閱讀框。
細胞毒性t細胞(cytotoxictlymphocyte,ctl)是介導適應性免疫應答的核心細胞，在抗感染、抗腫瘤以及超敏反應和自身免疫病的發生中起著至關重要的作用，其細胞膜上的t細胞受體(tcellreceptor,tcr)能夠特異性識別并結合抗原遞呈細胞表面mhci類分子與抗原肽的復合物，即mhc/抗原肽復合體分子。ctl表位是指與mhci類分子結合的抗原肽，是抗原分子中能被tcr特異性識別的線性片段或空間構象性結構，是引起免疫應答反應的基本抗原單位，在ctl活化過程中扮演著關鍵角色。
mhc系統指主要組織相容性復合體(majorhistocompatibilitycomplex,mhc)，是脊椎動物基因組中一組緊密連鎖的基因群，編碼表達mhci類和ii類蛋白分子。hla(humanleukocyteantigen)是人類的mhc系統，是人體最復雜的基因群，在人群中具有高度多態性。hla在抗原識別、抗原呈遞等機體免疫過程中發揮重要作用，是影響人體免疫反應的主要因素。hlai類分子主要負責將內源性hbv抗原呈遞給cd8+ctl，活化的ctls通過分泌穿孔素和顆粒酶等使病毒感染的肝細胞凋亡，同時分泌特定的細胞因子抑制hbv的復制。因此，動態監測hbv抗原特異性cd8+t細胞的數量和功能可以準確反映乙肝感染者針對hbv的特異性免疫功能狀態。由于不同人的hla分子型別不同，其對hbv不同抗原的加工、處理和提呈能力也不相同，從而引起不同程度的hbv抗原特異性免疫應答反應。根據乙肝患者不同的hla分子型別，選擇其所提呈的hbv特異性抗原肽，動態監測該hbv抗原肽特異性的cd8+t細胞的數量和功能，對hbv感染者的疾病進程監測、診斷與治療方案的制定、療效觀察和預后轉歸的判斷等都有重要意義，是實現乙肝精準醫學治療的重要技術手段。同時，利用這些hla-a分子高親和力結合的hbv特異性抗原肽，還可以制備多肽疫苗或基因疫苗，預防和治療hbv感染。
目前，國內外報道的與hla-a分子呈高親和力結合的hbv特異性抗原肽中，hla-a*0201、a*0203、a*0206、a*1101和a*2402等分子限制性的抗原肽序列被報道和鑒定的較多。而中國人群中頻率相對較高的hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等分子的限制性hbv抗原肽則較少報道。本專利通過生物信息學方法，利用六種在線表位預測數據庫對hla-a等位基因型限制的hbv特異性抗原表位肽進行預測，獲得一組分別與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等hla-a分子呈高親和力結合的hbv特異性抗原肽序列，為制備hbv感染的治療和預防性疫苗以及檢測hbv抗原特異性t細胞的試劑等提供候選抗原表位肽。
技術實現要素：
技術問題：本發明提供一種能制備hbv感染的治療和預防性疫苗以及研制hbv抗原特異性t細胞檢測試劑的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列。
技術方案：本發明的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列，為如下所示序列中的任一種：
進一步的，本發明中，該序列為乙肝病毒核心抗原hbcag、表面抗原hbsag、聚合酶蛋白hbpol或x蛋白hbx的抗原肽序列。
進一步的，本發明中，該序列能分別hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303、a*6801分子呈高親和力結合。
進一步的，本發明中，序列通過以下步驟制備：
1.1通過genebank數據庫或uniprot全球蛋白資源數據庫檢索獲得乙肝病毒蛋白氨基酸序列；
1.2利用六種表位預測數據庫syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen分別預測步驟1.1所得乙型肝炎病毒抗原中能分別與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303、a*6801分子呈高親和力結合的多肽序列；
1.3對步驟1.2所得六種在線表位預測網站的預測結果，選擇同一hla-a分子至少有兩種及以上方法都預測獲得高親和力結果的某一多肽序列作為乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列。
本發明的一種將上述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列在制備多肽疫苗或基因疫苗中的應用，是將與hla-a分子呈高親和力結合的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽制備成多肽疫苗或基因疫苗。
本發明的一種將上述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列在檢測乙型肝炎病毒抗原特異性t細胞中的應用，是以與hla-a分子呈高親和力結合的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽作為試劑，檢測乙型肝炎病毒抗原表位肽特異性胸腺依賴性淋巴細胞。
本發明的上述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列在檢測乙型肝炎病毒抗原特異性t細胞中的應用，所述試劑為酶聯免疫斑點法試劑、酶聯免疫吸附試驗試劑、人類白細胞抗原多聚體熒光染色或流式細胞分析法試劑。
本發明利用六種在線表位預測數據庫預測6種hla-a等位基因型限制性的hbv特異性抗原表位肽序列，獲得一組能分別與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等hla-a分子呈高親和力結合的hbv特異性抗原表位肽序列，為制備hbv感染的治療和預防性疫苗以及研制hbv抗原特異性t細胞的檢測試劑等提供了候選抗原表位肽。
1.選擇乙肝病毒核心抗原(hbcag)、表面抗原(hbsag)、聚合酶蛋白(hbpol)和x蛋白(hbx)氨基酸序列為靶向序列；
2.選擇預測結果獲得研究者的公認、具有較高準確性的、常用的六種表位預測數據庫：syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen預測上述6種hla-a分子限制性的hbv特異性抗原表位肽序列；
3.根據一定的預測標準，對六個在線表位預測網站的預測結果進行整合分析，獲得六個網站預測結果較一致的候選抗原肽序列。
本發明為乙肝病毒核心抗原(hbcag)、表面抗原(hbsag)、聚合酶蛋白(hbpol)和x蛋白(hbx)中能分別與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等蛋白分子呈高親和力結合的抗原肽序列；還涉及到以上述抗原肽為基礎的乙型肝炎多肽疫苗、基因疫苗、乙型肝炎的治療與預防方法，以及以上述抗原肽為基礎的檢測乙型肝炎病毒抗原特異性t細胞的試劑和方法。
有益效果：本發明與現有技術相比，具有以下優點：
預測獲得的hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等hla-a分子限制性的hbv特異性抗原表位肽以前也沒有被報道過。這些hla-a分子以前也沒有被報道有限制性的hbv抗原肽。因此這些新的抗原表位肽序列將為研制針對乙型肝炎治療性和預防性多肽疫苗和基因疫苗、設計檢測乙型肝炎病毒抗原特異性t細胞的試劑和方法等提供所需的關鍵抗原組分，即抗原表位肽序列；同時這些抗原表位肽也為針對這些特定hla-a等位基因的乙型肝炎患者進行個體化檢測和精準醫療提供了關鍵的抗原組分。
具體實施方式
本發明的hla-a分子限制性hbv特異性抗原肽，包括以下步驟：
1.通過genebank數據庫和uniprot全球蛋白資源數據庫檢索獲得hbv蛋白氨基酸序列，選擇研究最多的蛋白序列，最終選定的蛋白序列為hbsag(p03138)、hbcag(p03146)、hbpol(p03156)和hbx(p03165)。
2.利用六種常用表位預測數據庫syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen(http://www.syfpeithi.de/、http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/、ttp://www.sbc.su.se/～pierre/svmhc/、http://www.immuneepitope.org/tools.do/、http://www.cbs.dtu.dk/services/netmhc/、http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/epijen/epijen.htm/)分別將上述乙肝病毒抗原hbsag(p03138)、hbcag(p03146)、hbpol(p03156)和hbx(p03165)的氨基酸序列與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等hla-a分子中的每一種進行親和力和空間構象的吻合度分析，根據一定的標準預測篩選每種hla-a分子限制性的抗原表位肽序列，分別選擇長度為9和10個氨基酸的結合肽作為候選抗原表位肽。具體的篩選標準如下：syfpeithi預測選取評分>20或者排名在前10的肽序列；bimas預測選取評分>10或者排名在前10的肽序列；svmhc預測選取評分>0.5或者排名在前10的肽序列；iedb預測選取評ic50<500nm或者排名在前10的肽序列；netmhc預測選取rankthreshold<2.0rankthreshold<2.0或者排名在前10的肽序列；epijen預測選取ic50<500nm或者排名在前10的肽序列。
3.針對每一種hla-a分子，經不同數據庫預測出的表位肽再根據親和力從高到低進行排列，選取高親和力的肽序列作為該種hla-a分子限制性的hbv候選抗原表位肽。同時對六種在線表位預測網站的預測結果進行整合分析，對每一種hla-a分子，篩選至少達到兩種及以上方法篩選標準的某一表位肽作為該hla-a分子限制性的候選抗原表位肽。
表1是通過上述六個在線表位預測網站預測并最終篩選出的hla-a限制性hbv特異性抗原表位肽序列。
四種被用來預測抗原表位的乙型肝炎病毒抗原的氨基酸序列如下：
seqidno1：
hbsag(p03138)：
seqidno2：
hbcag(p03146)：
表1hla-a限制性hbv相關抗原表位的預測結果
---：該預測網站沒有針對該mhc分子的預測方法；
ns：沒有獲得該表位的計算數據。
seqidno3：
hbpol(p03156)：
seqidno4：
hbx(p03165)：
上述實施例僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和等同替換，這些對本發明權利要求進行改進和等同替換后的技術方案，均落入本發明的保護范圍。
sequencelisting
<110>東南大學
<120>乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列
<130>2017
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>389
<212>prt
<213>人工合成
<400>1
metglyglnasnleuserthrserasnproleuglyphepheproasp
151015
hisglnleuaspproalapheargalaasnthralaasnproasptrp
202530
asppheasnproasnlysaspthrtrpproaspalaasnlysvalgly
354045
alaglyalapheglyleuglyphethrproprohisglyglyleuleu
505560
glytrpserproglnalaglnglyileleuglnthrleuproalaasn
65707580
proproproalaserthrasnargglnserglyargglnprothrpro
859095
leuserproproleuargasnthrhisproglnalametglntrpasn
100105110
serthrthrphehisglnthrleuglnaspproargvalargglyleu
115120125
tyrpheproalaglyglyserserserglythrvalasnprovalleu
130135140
thrthralaserproleuserserilepheserargileglyasppro
145150155160
alaleuasnmetgluasnilethrserglypheleuglyproleuleu
165170175
valleuglnalaglyphepheleuleuthrargileleuthrilepro
180185190
glnserleuaspsertrptrpthrserleuasnpheleuglyglythr
195200205
thrvalcysleuglyglnasnserglnserprothrserasnhisser
210215220
prothrsercysproprothrcysproglytyrargtrpmetcysleu
225230235240
argargpheileilepheleupheileleuleuleucysleuilephe
245250255
leuleuvalleuleuasptyrglnglymetleuprovalcysproleu
260265270
ileproglyserserthrthrserthrglyprocysargthrcysmet
275280285
thrthralaglnglythrsermettyrprosercyscyscysthrlys
290295300
proseraspglyasncysthrcysileproileprosersertrpala
305310315320
pheglylyspheleutrpglutrpalaseralaargphesertrpleu
325330335
serleuleuvalprophevalglntrpphevalglyleuserprothr
340345350
valtrpleuservaliletrpmetmettrptyrtrpglyproserleu
355360365
tyrserileleuserpropheleuproleuleuproilephephecys
370375380
leutrpvaltyrile
385
<210>2
<211>183
<212>prt
<213>人工合成
<400>2
metaspileaspprotyrlysglupheglyalathrvalgluleuleu
151015
serpheleuproseraspphepheproservalargaspleuleuasp
202530
thralaseralaleutyrargglualaleugluserprogluhiscys
354045
serprohishisthralaleuargglnalaileleucystrpglyglu
505560
leumetthrleualathrtrpvalglyvalasnleugluaspproala
65707580
serargaspleuvalvalsertyrvalasnthrasnmetglyleulys
859095
pheargglnleuleutrpphehisilesercysleuthrpheglyarg
100105110
gluthrvalileglutyrleuvalserpheglyvaltrpileargthr
115120125
proproalatyrargproproasnalaproileleuserthrleupro
130135140
gluthrthrvalvalargargargglyargserproargargargthr
145150155160
proserproargargargargserglnserproargargargargser
165170175
glnserarggluserglncys
180
<210>3
<211>832
<212>prt
<213>人工合成
<400>3
metproleusertyrglnhispheargargleuleuleuleuaspasp
151015
glualaglyproleugluglugluleuproargleualaaspglugly
202530
leuasnargargvalalagluaspleuasnleuglyasnleuasnval
354045
serileprotrpthrhislysvalglyasnphethrglyleutyrser
505560
serthrvalprovalpheasnprohistrplysthrproserphepro
65707580
asnilehisleuhisglnaspileilelyslyscysgluglnpheval
859095
glyproleuthrvalasnglulysargargleuglnleuilemetpro
100105110
alaargphetyrprolysvalthrlystyrleuproleuasplysgly
115120125
ilelysprotyrtyrprogluhisleuvalasnhistyrpheglnthr
130135140
arghistyrleuhisthrleutrplysalaglyileleutyrlysarg
145150155160
gluthrthrhisseralaserphecysglyserprotyrsertrpglu
165170175
glnaspleuglnhisglyalagluserphehisglnglnsersergly
180185190
ileleuserargproprovalglyserserleuglnserlyshisarg
195200205
lysserargleuglyleuglnserglnglnglyhisleualaargarg
210215220
glnglnglyargsertrpserileargalaglyphehisprothrala
225230235240
argargpropheglyvalgluproserglyserglyhisthrthrasn
245250255
phealaserlysseralasercysleuhisglnserprovalarglys
260265270
alaalatyrproalavalserthrpheglulyshissersersergly
275280285
hisalavalgluphehisasnleuproproasnseralaargsergln
290295300
sergluargprovalpheprocystrptrpleuglnpheargasnser
305310315320
lysprocysserasptyrcysleuserleuilevalasnleuleuglu
325330335
asptrpglyprocysalagluhisglygluhishisileargilepro
340345350
argthrproserargvalthrglyglyvalpheleuvalasplysasn
355360365
prohisasnthralagluserargleuvalvalasppheserglnphe
370375380
serargglyasntyrargvalsertrpprolysphealavalproasn
385390395400
leuglnserleuthrasnleuleuserserasnleusertrpleuser
405410415
leuaspvalseralaalaphetyrhisleuproleuhisproalaala
420425430
metprohisleuleuvalglyserserglyleuserargtyrvalala
435440445
argleuserserasnserargileleuasnasnglnhisglythrmet
450455460
proaspleuhisasptyrcysserargasnleutyrvalserleuleu
465470475480
leuleutyrglnthrpheglyarglysleuhisleutyrserhispro
485490495
ileileleuglyphearglysileprometglyvalglyleuserpro
500505510
pheleuleualaglnphethrseralailecysservalvalargarg
515520525
alapheprohiscysleualaphesertyrmetaspaspvalvalleu
530535540
glyalalysservalglnhisleugluserleuphethralavalthr
545550555560
asnpheleuleuserleuglyilehisleuasnproasnlysthrlys
565570575
argtrpglytyrserleuasnphemetglytyrvalileglycystyr
580585590
glyserleuproglngluhisileileglnlysilelysglucysphe
595600605
arglysleuproileasnargproileasptrplysvalcysglnarg
610615620
ilevalglyleuleuglyphealaalaprophethrglncysglytyr
625630635640
proalaleumetproleutyralacysileglnserlysglnalaphe
645650655
thrpheserprothrtyrlysalapheleucyslysglntyrleuasn
660665670
leutyrprovalalaargglnargproglyleucysglnvalpheala
675680685
aspalathrprothrglytrpglyleuvalmetglyhisglnargmet
690695700
argglythrpheseralaproleuproilehisthralagluleuleu
705710715720
alaalacysphealaargserargserglyalaasnileileglythr
725730735
aspasnservalvalleuserarglystyrthrserpheprotrpleu
740745750
leuglycysalaalaasntrpileleuargglythrserphevaltyr
755760765
valproseralaleuasnproalaaspaspproserargglyargleu
770775780
glyleuserargproleuleuargleupropheargprothrthrgly
785790795800
argthrserleutyralaaspserproservalproserhisleupro
805810815
aspargvalhisphealaserproleuhisvalalatrpargpropro
820825830
<210>4
<211>154
<212>prt
<213>人工合成
<400>4
metalaalaargleucyscysglnleuaspproalaargaspvalleu
151015
cysleuargprovalglyalagluserargglyargprophesergly
202530
serleuglythrleuserserproserproseralavalprothrasp
354045
hisglyalahisleuserleuargglyleuprovalcysalapheser
505560
seralaglyprocysalaleuargphethrseralaargargmetglu
65707580
thrthrvalasnalahisglnileleuprolysvalleuhislysarg
859095
thrleuglyleuseralametserthrthraspleuglualatyrphe
100105110
lysaspcysleuphelysasptrpglugluleuglyglugluilearg
115120125
leulysvalphevalleuglyglycysarghislysleuvalcysala
130135140
proalaprocysasnphephethrserala
145150