本發明涉及生物工程領域，具體地說涉及一種分離的母乳內源性抗菌多肽及其應用。
背景技術：
：自1939年第一種抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)從土壤芽孢桿菌中被分離以來，在不同生物中陸續發現了2490多種抗菌肽，并且新的抗菌肽還在不斷地開發和鑒定中。抗菌肽是一類由5～100個氨基酸組成的寡肽，具有廣譜的抗菌活性，作用靶標包括革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌、病毒、寄生蟲以及腫瘤細胞等，使它迅速成為潛在的治療藥物。抗菌肽的殺菌機制包括通過破壞細胞膜的完整性，抑制蛋白、dna和rna的合成，或與胞內某些特定的靶標相結合從而殺死細菌。一般來說，一種抗菌肽僅對一類微生物有效，但是也有一些例外的抗菌肽針對不同的微生物具有不同的殺傷機制，例如抗菌肽indolicidin不僅可以通過滲透細胞抑制dna的合成殺傷大腸桿菌，而且可以通過損傷真菌細胞膜殺傷真菌，還可以抑制hiv-整合酶抑制hiv活性。還有一些抗菌肽對不同類型微生物具有相同的殺傷模式，pmap-23能夠在細胞膜形成孔隙殺死真菌和寄生蟲。抗菌肽不僅可以破壞微生物細胞膜而且可以抑制功能蛋白的合成產生快速殺傷效應的獨特機制使其成為理想的抗生素替代品。耐藥菌、生物被膜、滯留菌對傳統抗生素具有很強的抗性，并且它們在感染中發揮著重要作用。利用抗菌肽破壞細胞膜的效應殺死耐藥菌以及對生物被膜基質蛋白酶的作用清除生物被膜，可以有效控制感染的發生，因此具有潛在的開發應用價值。目前多肽類藥物由于其活性和安全性高、特異性強、成藥性高，正快速進入市場。近年來，母乳已被鑒定出含有超過300種內源性多肽，其中抗菌肽作為母乳中重要的活性成分之一，是抵抗新生兒感染、消滅致病菌的有效武器，如：人乳鐵蛋白來源的短肽hlf(1-11)不僅可以抵抗耐藥金黃色葡萄球菌感染，而且其衍生物在多種動物模型中表現出廣譜的抗菌活性。此外，母乳內源性多肽含量豐富、種類繁多，與小分子藥物相比，具有分子量小、活性高、無耐受性和毒副反應等優勢，展現出母乳內源性多肽作為抗菌藥物的良好潛質。因此，從母乳內源性多肽的角度進一步尋找抗菌肽將會給臨床治療帶來新的突破口。技術實現要素：發明目的：本發明的目的是提供一種分離的母乳內源性抗菌多肽，本發明還有一個目的是提供編碼前述多肽的核苷酸，本發明還有一個目的是提供含有前述核苷酸序列的表達載體；本發明還有一個目的是提供前述表達載體轉染的宿主細胞；本發明還有一個目的是提供含有前述多肽的組合物；本發明還有一個目的是提供前述多肽在制備抗小腸結腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌藥物上的應用。技術方案：本發明所述的一種分離的母乳內源性抗菌多肽，其至少包含序列如seqidno.1所示的多肽片段。序列seqidno.1為17個氨基酸組成的多肽(β-casein190)，其本身對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森菌都有良好的抑制效果，對于含有該序列的更長的多肽片段，優選的長度應當不超過25個氨基酸，基于β-casein190多肽在其上游和下游進一步連接有其他氨基酸，其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森菌同樣也有抑菌效果，有的對其中某個菌種的抑菌效果更優秀。例如β-casein201(氨基酸序列seqidno.3)對金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌的抑菌效果更優秀。而β-casein204(氨基酸序列seqidno.4)不僅對金黃色葡萄球菌有良好的抑菌效果，對大腸桿菌的抑菌效果更優。前述多肽的氨基酸序列羅列如下：序列編號多肽名稱氨基酸序列氨基酸數seqidno.1β-casein190lnpthqiypvtqplapv17seqidno.2β-casein200llnpthqiypvtqplapv18seqidno.3β-casein201elllnpthqiypvtqplapv20seqidno.4β-casein204lnpthqiypvtqplapvhnpis22seqidno.5β-casein205lnpthqiypvtqplapvhnpisv23本發明所述的所有母乳內源性抗菌多肽都來源于人類母乳中的β-酪蛋白，結構穩定，不易在體內降解。所述多肽的獲得可按照氨基酸序列通過固相合成方法獲得；或者通過宿主微生物或細胞內克隆并表達攜帶編碼所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通過現有的重組dna技術制備獲得。所使用的表達載體和宿主細胞均為重組技術為公眾所知的。表達載體例如pet載體、pgex載體；宿主細胞例如大腸桿菌(e.coli)，放線菌(actinomycetes)，芽孢桿菌(bacillus)，鏈霉菌(streptomyces)，本發明所述的多肽可用常規的酶切方法將其從宿主細胞中分離，也可以通過常規的液相色譜法進行分離和純化，上述的分離純化方法都是本領域技術人員公知的技術。本發明還提供編碼前述多肽的核苷酸，其至少包含序列為seqidno.6至seqidno.10的核苷酸序列。所述多肽可以單獨應用，本發明還提供一種多肽組合物，該組合物含有seqidno.1至seqidno.5任意一個多肽或多個多肽的組合。所述多肽或所述多肽組合物可制備成藥學上可接受的載體，包括但不限于膠囊、片劑、錠劑、丸劑、滴丸、栓劑、噴霧、乳膏、貼劑等形式。本發明所述多肽對小腸結腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌效果，通過電鏡掃描發現其主要通過破壞細菌細胞膜的完整性從而抑制細菌。可用于制備抗小腸結腸炎耶爾森菌、抗大腸桿菌、抗金黃色葡萄球菌的藥物。附圖說明圖1為試驗例1中β-casein201的抑菌效果圖；圖2為試驗例1中β-casein204的抑菌效果圖；圖3為試驗例2中β-casein201熒光顯微鏡下觀察的染色結果；圖4為試驗例2中β-casein204熒光顯微鏡下觀察的染色結果；圖5為試驗例3的試驗菌在β-casein201處理下的掃描電鏡圖；圖6為試驗例3的試驗菌在β-casein204處理下的掃描電鏡圖；圖7為試驗例3的試驗菌在β-casein201處理下的透射電鏡圖；圖8為試驗例3的試驗菌在β-casein204處理下的透射電鏡圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明。抑菌試驗以兩個優選方案β-casein201、β-casein204為代表進行，其余的多肽因與β-casein201、β-casein204的結構高度相似，且都為天然母源性內源肽的片段，其理化性質相似，經檢驗都具備一定的抑菌效果。實施例1委托上海科肽生物科技有限公司通過固相法合成如下序列：seqidno.1lnpthqiypvtqplapvseqidno.2llnpthqiypvtqplapvseqidno.3elllnpthqiypvtqplapvseqidno.4lnpthqiypvtqplapvhnpisseqidno.5lnpthqiypvtqplapvhnpisv通過在線工具獲取前述多肽序列的主要生物學參數如下：seqidno.1等電點(pi)為6.74，分子質量(mw)為1888.20da，具有17個氨基酸，較低的相對分子質量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩定系數為50.86，表明該抗菌多肽較為穩定，不易被胃酸所降解破壞。脂溶指數和親水性分別為108.82和-0.029，表現為弱的親水性。seqidno.2等電點(pi)為6.74，分子質量(mw)為2001.36da，具有18個氨基酸，較低的相對分子質量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩定系數為48.59，脂溶指數和親水性分別為124.44和0.183，表現為弱的疏水性。seqidno.3等電點(di)為5.24，分子質量(mw)為2243.63da，具有20個氨基酸，較低的相對分子質量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩定系數為44.74，脂溶指數和親水性分別為131.50和0.180，表現為弱的疏水性。seqidno.4等電點(pi)為6.92，分子質量(mw)2436.88da，具有22個氨基酸，較低的相對分子質量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩定系數為51.03，脂溶指數和親水性分別為101.82和-0.232，表現為弱的親水性。seqidno.5等電點(pi)為6.92，分子質量(mw)為2535.93da，具有23個氨基酸，較低的相對分子質量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩定系數為49.25，脂溶指數和親水性分別為110.00和-0.039，表現為弱的親水性。上述序列都是來源于人類母乳中β-酪蛋白的天然序列，這五個序列除了通過化學固相合成法獲得，還可以通過對長鏈多肽通過生物酶切技術獲得，亦可通過宿主微生物或細胞內克隆并表達攜帶編碼所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通過現有的重組dna技術制備獲得。所使用的表達載體和宿主細胞均為重組技術為公眾所知的。表達載體例如pet載體、pgex載體；宿主細胞例如大腸桿菌(e.coli)，放線菌(actinomycetes)，芽孢桿菌(bacillus)，鏈霉菌(streptomyces)，本發明所述的多肽可用常規的酶切方法將其從宿主細胞中分離，也可以通過常規的液相色譜法進行分離和純化，上述的分離純化方法都是本領域技術人員公知的技術。編碼上述多肽的核苷酸序列對應如下：seqidno.6，編碼氨基酸β-casein190：cttaaccccacccaccagatctaccctgtgactcagccacttgccccagtt；seqidno.7編碼氨基酸β-casein200：ctacttaaccccacccaccagatctaccctgtgactcagccacttgccccagtt；seqidno.8編碼氨基酸β-casein201：gaacttctacttaaccccacccaccagatctaccctgtgactcagccacttgccccagtt；seqidno.9編碼氨基酸β-casein204：cttaaccccacccaccagatctaccctgtgactcagccacttgccccagttcataaccccattagt；seqidno.10編碼氨基酸β-casein205：cttaaccccacccaccagatctaccctgtgactcagccacttgccccagttcataaccccattagtgtc。實施例2實施例1所述的多肽可以單獨應用，除此之外，這些多肽還可以多肽組合物聯合使用。多肽組合物中包含序列為seqidno.1至seqidno.5中至少兩個多肽，優選至少包含序列為seqidno.3和seqidno.4兩種多肽序列。實施例3本實施例提供前述實施例1所述的一種多肽，或者實施例2所述的多肽組合物可制備成藥學上可接受的載體，例如：膠囊、片劑、錠劑、丸劑、滴丸、栓劑、噴霧、乳膏、貼劑等形式。試驗例1抑菌試驗抗菌多肽的合成與稀釋本試驗實施例1中固相合成獲得的抗菌多肽β-casein201和β-casein204多肽分別為例。取1mg多肽，用無菌雙蒸水稀釋成1mg/ml-20℃儲存備用。菌株及培養大腸桿菌(e.coli，atcc25922)、金黃色葡萄球菌(s.aureus，atcc25923)和小腸結腸炎耶爾森菌(y.enterocolitica，actt23715)來源于美國菌種保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)。每3ml無菌lb培養基中(胰蛋白胨10g/l，酵母膏提取物5g/l，nacl10g/l)接種30ul菌種，于37℃恒溫搖動培養至生長對數期。通過手持式細胞計數儀(milliporescepter2.0)檢測細菌濃度至1,000-5,000cfu/ml。抑菌實驗lb固態培養基(lb培養基加入瓊脂粉15g/l)，高溫高壓滅菌后冷卻至50℃左右倒入10cm無菌培養皿中。采用瓊脂糖孔穴擴散法即將兩種處于生長對數期試驗菌分別均勻接種至lb瓊脂平板后，將帶有β-casein201/β-casein204或無菌水(對照組)的無菌紙片放置于接種試驗菌的lb瓊脂平板。抗菌多在瓊脂膠內向四周自由擴散，其濃度隨擴散距離增大而降低，在藥物一定的擴散距離內，由于抗菌多的抗菌效應，試驗菌不能生長，此無菌生長的范圍稱為抑菌圈，抑菌圈的大小與抗菌多的抑菌效應成正比。如圖1所示，圖1是針對β-casein201的抑菌實驗結果。其中，上排為對照組，下派為加入抑菌多肽的試驗組；左右兩圖分別接種金黃色為葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌。從圖中可以看出，加入多肽的紙片周圍出現了明顯的抑菌圈，而對照組(加滅菌雙蒸水)則沒有明顯抑制區域，表明序列β-casein201對金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌均具有明顯的抑制作用。如圖2所示，圖2是針對β-casein204的抑菌實驗結果。其中，上排為對照組，下派為加入抑菌多肽的試驗組；左右兩圖分別接種大腸桿菌和金黃色為葡萄球菌。從圖中可以看出，加入多肽的紙片周圍出現了明顯的抑菌圈，而對照組(加滅菌雙蒸水)則沒有明顯抑制區域，表明序列β-casein204對大腸桿菌和金黃色為葡萄球菌均具有明顯的抑制作用。試驗例2免疫熒光試驗采用live/deadbaclightkitl13152檢測試劑盒(thermofisher，usa)。將試劑盒內的a液和b液混合于5ml無菌雙蒸水，綠色熒光核酸染料(syto9)終濃度為6um，紅色熒光核酸染料(propidiumiodide，pi)終濃度為30um。細菌膜完整的顯示綠色，膜破裂的顯示紅色。準備25ml菌液，室溫10,000rpm離心10min，去除上清液，保留沉淀。用2ml0.85％nacl溶液重懸沉淀。取1ml重懸液加入含20ml0.85％nacl溶液的50ml離心管中，室溫孵育1h，每15min混合一次。1小時后室溫10,000rpm離心10min，并用0.85％nacl溶液洗滌2次后用10ml0.85％nacl溶液重懸。每毫升細菌懸液中加入3ul染色劑混合物徹底混勻，室溫避光孵育15min。取5ul反應液滴至載玻片并蓋上18mm蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。通過免疫熒光試驗，如圖3所示，與對照組相比，β-casein201處理組中，紅色熒光增多(菌體細胞膜破裂，pi進入細胞核與核酸結合，顯示紅色熒光)，綠色熒光減少(菌體細胞膜完整，染成綠色)，說明該β-casein201對金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌均具有明顯的殺傷作用。如圖4所示，β-casein204多肽處理組中，紅色熒光增多(菌體細胞膜破裂，pi進入細胞核與核酸結合，顯示紅色熒光)，綠色熒光減少(菌體細胞膜完整，染成綠色)，說明β-casein204對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的殺傷作用。試驗例3電鏡觀察試驗處于對數生長期的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌分別于室溫12,000離心3min后，用0.1m的pbs洗滌一次，并用pbs重懸。通過手持式細胞計數儀(milliporescepter2.0)將菌液濃度調整為1×108cfu/ml，并分別與抗菌多肽于37℃孵育1h，使抗菌多肽終濃度為100ug/ml，細菌與無菌雙蒸水混合作為對照。1小時后，菌液多肽混合物于室溫12,000離心3min，0.1m的pbs洗滌兩次，去除上清液。2.5％的戊二醛4℃固定4h，30％-50％-70％-90％-100％乙醇梯度脫水，每步驟15min并吹打混勻；將脫水后的菌液滴加之載玻片，通風廚干燥后將樣品分別在-20℃、-20℃和-80℃冷凍過夜；樣品送至南京醫科大學進行掃描電鏡觀察；2.5％的戊二醛4℃固定4h，樣品送至南京醫科大學進行透射電鏡觀察。通過掃描電鏡發現，抗菌多肽處理組中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌均觀察到細胞膜邊緣粗糙不清晰的紊亂結構(如圖5、圖6試驗組所示)，而對照組中均為完整連續光滑的膜結構(如圖5、圖6對照組所示)，說明β-casein201和β-casein204通過破壞細菌細胞膜從而抑制細菌；進一步借助透射電鏡可以清晰的觀察到抗菌多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌的破壞。與對照組相比，β-casein201和β-casein204處理組中，細菌細胞膜幾乎被完全破壞，出現大量氣泡樣結構，細胞內容物外泄，肌動蛋白細胞骨架幾乎無法識別(如圖7、圖8試驗組所示)，進一步說明了本發明的抗菌多肽對細菌的殺傷是通過破壞細菌細胞膜的完整性，使其失去活力。<110>南京市婦幼保健院<120>一種分離的母乳內源性抗菌多肽及其應用<130>17nj2v0070008<160>10<141>patentinversion3.1<210>1<211>17<212>prt<213>人工序列<400>1leuasnprothrhisglniletyrprovalthrglnproleualaproval151015<210>2<211>18<212>prt<213>人工序列<400>2leuleuasnprothrhisglniletyrprovalthrglnproleualaproval151015<210>3<211>20<212>prt<213>人工序列<400>3gluleuleuleuasnprothrhisglniletyrprovalthrglnproleualaproval15101520<210>4<211>22<212>prt<213>人工序列<400>4leuasnprothrhisglniletyrprovalthrglnproleualaprovalhisasnproileser15101520<210>5<211>23<212>prt<213>人工序列<400>5leuasnprothrhisglniletyrprovalthrglnproleualaprovalhisasnproileserval15101520<210>6<211>51<212>dna<213>人工序列<400>6ctgaacccgacccatcagatttatccggtgacccagccgctggcgccggtg51<210>7<211>54<212>dna<213>人工序列<400>7ctgctgaacccgacccatcagatttatccggtgacccagccgctggcgccggtg54<210>8<211>60<212>dna<213>人工序列<400>8gaactgctgctgaacccgacccatcagatttatccggtgacccagccgctggcgccggtg60<210>9<211>66<212>dna<213>人工序列<400>9ctgaacccgacccatcagatttatccggtgacccagccgctggcgccggtgcataacccgattagc66<210>10<211>69<212>dna<213>人工序列<400>10ctgaacccgacccatcagatttatccggtgacccagccgctggcgccggtgcataacccgattagcgtg69當前第1頁12