本發明屬于藥物領域，具體涉及一種吡啶類化合物或其藥學上可接受的鹽、其制備方法、以及它們作為irak4抑制劑的用途。
技術背景
白細胞介素-1受體相關激酶-4(irak4)是細胞內一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，系irak家族的成員之一。irak4主要由n端保守的死亡結構域(dd)、鉸鏈區、c端的中央激酶結構域(kd)組成(wangz,etal.structure,2006,14(2):1835-1844)。dd區是irak4與接頭蛋白髓系分化因子88(myd88)相結合的區域，它在irak4發揮分子識別及激活下游信號通路中起重要的作用。kd區由12個亞區域構成，具有典型的絲/蘇氨酸激酶結構域特征。irak4主要的功能是通過kd區將其底物磷酸化，進而激活下游信號分子。研究表明，irak4是toll樣受體(tlr)/白介素-1受體(il-1r)介導的炎癥信號轉導通路下游的關鍵因子，在機體炎癥反應中發揮重要的作用(simsje,etal.natrevimmunol,2010,10(2):89-102)。
tlrs/il-1r信號通路不僅是固有免疫系統識別病原相關分子模式(pamp)的主要途徑，而且參與適應性免疫應答的調控。研究表明，tlrs和il-1r與配體結合后通過其tir結構域招募myd88蛋白，隨后myd88分子通過其n端的dd區進一步將irak4招募到tlrs/il-1r復合物中，并與irak1緊密接觸，irak4通過kd區發生自身磷酸化，隨即激活irak1，從而向下游傳遞信號至e3泛素連接酶tnf受體相關因子6(traf6)，活化絲氨酸/蘇氨酸激酶tak1，進而激活nf-κb及mapk信號通路，引起多種炎癥細胞因子和抗凋亡分子的釋放(flannerys,etal.biochempharmacol,2010,80(12):1981-1991)。
irak4依賴性的tlr/il-1r信號通路的過度激活已經被證明與以下疾病的發生發展相關：痛風、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、心肌梗死、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥、代謝綜合癥、膿血癥、炎癥性腸病、哮喘、過敏和器官移植后的排斥反應(dinarelloca.eurjimmunol,2011,41(5):1203-1217；keoghb,etal.trendspharmacolsci,2011,32(7):435-442；manndl.circres,2011,108(9):1133-1145；carioe.inflammboweldis,2010,16(9):1583-1597)。實驗表明，在lps或cpg誘導的人白細胞中，irak4抑制劑能夠有效地阻斷促炎細胞因子腫瘤壞死因子(tnf)的產生；在膠原蛋白誘導關節炎的小鼠模型中，irak4抑制劑能夠顯著抑制tnf的釋放，從而控制疾病的進程；在myd88依賴性炎癥性痛風小鼠模型中，irak4抑制劑能夠劑量依賴性地阻斷白細胞浸潤(priscillan,etal.jexpmed,2015,13(212):2189-2201)。
近年來，在多種血液腫瘤中發現myd88蛋白編碼區第265位亮氨酸突變為脯氨酸(l265p)，從而導致irak4介導的nf-κb信號通路的持續激活、放大，進而促進細胞惡性增殖。在彌漫性大b細胞淋巴瘤中，由于myd88蛋白出現l265p突變，從而導致irak4的過度活化(ngovn,etal.nature,2011,470(7332):115-119)。myd88l265p突變導致的irak4過度活化在慢性淋巴性白血病、華氏巨球蛋白血癥中也得到確證，通過抑制irak4的活性能夠降低細胞內il-6、il-10水平，從而抑制細胞的惡性增殖與分化(puentexs,etal.nature,2011,475(7354):101-105；treonsp,etal.nengljmed,2012,367(9):826-833)。
此外，文獻還報道了irak4抑制劑與b細胞受體信號通路中的抑制劑(例如：btk抑制劑、syk抑制劑、bcl-2抑制劑)的聯合用藥可以起協同作用(priscillan,etal.jexpmed,2015,13(212):2189-2201)。在攜帶myd88l265p突變的彌漫性大b細胞淋巴瘤中，irak4抑制劑與btk抑制劑ibrutinib的聯用能夠顯著增強對腫瘤細胞的殺傷力，更能有效地抑制ikk的活性，促進細胞的凋亡(chaudharyd,etal.blood,2013,122(21):3833)。
綜上所述，irak4已成為炎癥、免疫相關疾病和血液腫瘤治療領域中的一個重要靶標(chaudharyd,etal.jmedchem.2015,58(1):96-110)。pf-06650833是由pfizer公司研發的小分子irak4抑制劑，是該靶點至今唯一進入臨床試驗階段的小分子化合物，目前正在開展治療類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等臨床試驗。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題在于提供了一種吡啶類化合物或其藥學上可接受的鹽、其制備方法、藥物組合物及應用。本發明的化合物具有良好的irak4抑制活性，可以用于治療和/或預防irak4引起的相關疾病。
本發明公開通式(i)所示的吡啶類化合物或其藥學上可接受的鹽：
其中：
r1代表氫、鹵素、羥基、硝基、三氟甲基、氰基、nh(co)r4、c1-c8烷基、c1-c8烷氧基或c3-c6環烷基；
r2代表氫、鹵素或nr5r6；
r3代表氫、鹵素或氨基；
r4代表c1-c8烷基、c3-c6環烷基、c5-c10芳基或c5-c10芳雜環基；其中所述的芳雜環基可任選地包含一個或多個選自o、s或n的其它雜原子；其中所述的芳基或芳雜環基可任選地被下述相同或不相同的取代基單取代至五取代，所述的取代基選自：鹵素、三氟甲基、氰基、硝基或羥基；
r5和r6可相同或不相同，代表氫、c1-c8烷基，或r5和r6與跟它們連接的氮一起形成5-7元雜環基團，該雜環基團可任選地包含一個或多個選自o、s或n的其它雜原子，并且該雜環基團可任選地由下述相同或不同的取代基單取代至五取代，所述取代基選自：甲酰胺基、鹵素、羥基、硝基、氰基或氨基。
進一步地，具有通式(i)所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其特征在于：
r1代表氫、鹵素、羥基、硝基、三氟甲基、氰基或nh(co)r4；
r2代表氫或nr5r6；
r3代表氫或氨基；
r4代表c1-c8烷基、c3-c6環烷基、c5-c10芳基或c5-c10芳雜環基；其中所述的芳雜環基可任選地包含一個或多個選自o、s或n的其它雜原子；其中所述的芳基或芳雜環基可任選地被下述相同或不相同的取代基單取代至五取代，所述的取代基選自：三氟甲基或羥基；
r5和r6可相同或不相同，代表氫、c1-c8烷基，或r5和r6與跟它們連接的氮一起形成5-7元雜環基團，該雜環基團可任選地包含一個或多個選自o、s或n的其它雜原子，并且該雜環基團可任選地由下述相同或不同的取代基單取代至五取代，所述取代基選自：甲酰胺基。
更進一步地，具有通式(i)所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其特征在于：
r1代表氫、鹵素或nh(co)r4；
r2代表氫、哌啶或哌啶-4-甲酰胺；
r3代表氫或氨基；
r4代表甲基、乙基、環己基或苯基。
具體來說，通式(i)化合物或其藥學上可接受的鹽，其特征在于所述化合物優先選自：
n-(6-乙酰氨基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-1)；
n-(6-丙酰氨基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-2)；
n-(6-(環己烷甲酰氨基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-3)；
n-(6-苯甲酰氨基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-4)；
n-(6-乙酰胺基-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-5)；
n-(2-(哌啶-1-基)-6-丙酰胺基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-6)；
n-(6-(環己烷甲酰胺基)-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-7)；
n-(6-苯甲酰氨基-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-8)；
n-(6-氯-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-9)；
n-(2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-10)；
n-(2-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)-6-氯吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-11)；
n-(2-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-12)；
n-(6-乙酰氨基吡啶-3-基)-2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-13)；
2-氨基-n-(6-(環己烷甲酰氨基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-14)；
2-氨基-n-(6-苯甲酰氨基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-15)；
n-(6-乙酰氨基-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)-2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-16)；
2-氨基-n-(6-(環己烷甲酰氨基)-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-17)；
2-氨基-n-(6-苯甲酰氨基-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-18)；
2-氨基-n-(6-氯-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-19)；
2-氨基-n-(2-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)-6-氯吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-20)；
下面藥理實驗中涉及的化合物代號等同于此處代號所對應的化合物。
本發明的另一目的在于提供通式(i)所示化合物的制備方法，其特征在于：
a)當r2為h，r3為h時，通式(i)所示化合物的制備方法為：以氰乙酸甲酯為起始原料，與原甲酸三乙酯反應生成中間體1，1在水合肼中于100℃環合得到3-氨基-1h-吡唑-4-羧酸甲酯2，2與1,1,3,3-四甲氧基丙烷反應制得吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸甲酯3，3經氫氧化鉀水解得到吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸4；以5-硝基吡啶-2-胺為原料，與各種酰氯反應制得中間體5a-d，5a-d經zn粉/nh4cl還原制得中間體6a-d；最后，中間體4與二氯亞砜反應制得酰氯后再與6a-d縮合生成目標化合物a-1～a-4：
其中，r4的定義如前所述；
b)當r2為哌啶，r3為h時，通式(i)所示化合物的制備方法為：以2,6-二氯-3-硝基吡啶為起始原料，與哌啶發生親核取代反應制得6-氯-3-硝基-2-(哌啶-1-基)吡啶7a，7a與氨水在封管中反應得到5-硝基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-胺8，8分別與各種酰氯反應制得中間體9a-d，9a-d經zn粉/nh4cl還原得到中間體10a-d，最后中間體4與二氯亞砜反應制得酰氯后再與9a-d縮合生成目標化合物a-5～a-8：
其中，r4的定義如前所述；
c)當r1為h或cl，r3為h時，通式(i)所示化合物的制備方法為：以2,6-二氯-3-硝基吡啶為起始原料，分別與哌啶、哌啶-4-甲酰胺發生親核取代反應制得中間體7a-b，7a-b經zn粉/nh4cl還原生成中間體11a-b，或經pd/h2還原得中間體12a-b，最后中間體4與二氯亞砜反應制得酰氯后再與11a-b、12a-b縮合生成目標化合物a-9～a-12：
其中，r2的定義如前所述；
d)當r3為氨基時，通式(i)所示化合物的制備方法為：以氰乙酸甲酯為起始原料，與三氯乙腈制得中間體13，13在水合肼中于120℃環合得到3,5-二氨基-1h-吡唑-4-羧酸甲酯14，14與1,1,3,3-四甲氧基丙烷在2m稀鹽酸溶液中反應制得2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸甲酯15，15經氫氧化鉀水解得到2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸16，最后中間體16與二氯亞砜反應制得酰氯后再與胺基吡啶縮合生成目標化合物a-13～a-20：
其中，r1和r2的定義如前所述。
所述通式(i)化合物的藥學上可接受的鹽可通過一般的化學方法合成。
一般情況下，鹽的制備可以通過游離堿或酸與等化學當量或過量酸(無機酸或有機酸)或堿(無機堿或有機堿)在合適的溶劑或溶劑組合物中反應制得。
本發明還提供了一種藥物組合物，其由治療上有效量的活性組分和藥學上可接受的輔料組成；所述的活性組分包括通式(i)化合物和其藥學上可接受的鹽中的一種或多種。所述藥物組合物中，所述的輔料包括藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。
根據治療目的可將藥物組合物制成各種類型的給藥單位劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體、懸浮液、乳液、顆粒劑、膠囊、栓劑和針劑(溶液和懸浮液)等，優選片劑、膠囊、液體、懸浮液、和針劑(溶液和懸浮液)。
為了使片劑、丸劑或栓劑形式的藥物組合物成形，可使用本領域任何已知并廣泛使用的賦形劑。
為了制備針劑形式的藥物組合物，可將溶液或懸浮液消毒后(最好加入適量的氯化鈉，葡萄糖或甘油)，制成與血液等滲壓的針劑。在制備針劑時，也可以使用本領域內任何常用的載體。例如：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、聚乙氧基化的異硬脂醇和聚乙烯脫水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，還可以加入通常溶解劑和緩沖劑等。
本發明所述的組合物在藥物組合物中的含量無特殊限制，可在很寬的范圍內進行選擇，通常可為質量百分比的5～95％，優先為質量百分比的30～85％。
本發明所述的藥物組合物的給藥方法沒有特殊限制。可根據患者年齡、性別和其它條件及癥狀，選擇各種劑型的制劑給藥。
本發明另外提供了所述通式(i)化合物、其藥學上可接受的鹽或所述藥物組合物在制備irak4抑制劑中的應用。所述的irak4抑制劑用于治療患者的自身免疫性疾病、炎性疾病、癌癥、異種免疫性疾病或血栓栓塞。
所述的自身免疫性疾病和炎性疾病包括但不限于：類風濕性關節炎、骨關節炎、慢性阻塞性肺疾病、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、潰瘍性結腸炎、腸道應激綜合癥中的一種或多種。
所述的癌癥包括但不限于：b細胞性慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、彌漫性大b細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血癥中的一種或多種。
本發明還提供了所述通式(i)化合物、其藥學上可接受的鹽或所述藥物組合物可以和一種或多種其它種類的治療劑和/或治療方法聯合用于治療由irak4介導的相關疾病。
所述其它種類的治療劑和/或治療方法包括但不限于：免疫抑制劑、靶向抗腫瘤藥物、糖皮質激素、非甾體抗炎藥、抗腫瘤疫苗、過繼性細胞免疫治療或放射治療。
所述的免疫抑制劑包括但不限于：6-巰基嘌呤、環孢素、他克莫司、抗淋巴細胞球蛋白、抗tac單抗。
所述的糖皮質激素包括但不限于：氫化可的松、地塞米松、倍他米松、強的松。
所述的非甾體抗炎藥包括但不限于：阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸、羅非昔布。
所述的靶向抗腫瘤藥物包括但不限于：蛋白激酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑、異檸檬酸脫氫酶抑制劑、基于表觀遺傳學的抗腫瘤藥物或細胞周期信號通路抑制劑。
所述的蛋白激酶抑制劑包括但不限于：btk抑制劑、pi3k抑制劑、syk抑制劑、jak抑制劑。
具體實施方式
為了進一步闡明本發明，下面給出一系列實施例，這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發明具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
實施例1
(e)-2-氰基-3-乙氧基丙烯酸甲酯(1)的制備
將氰乙酸甲酯(5.0g,50.5mmol)和原甲酸三乙酯(7.6g,51.0mmol)加入20ml乙酸酐中，回流攪拌6h，冷卻，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，得淡黃色固體7.1g，產率91％。1hnmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):7.91(s,1h),4.06(q,j＝5.9hz,2h),3.87(s,3h),1.26(t,j＝5.9hz,3h).
3-氨基-1h-吡唑-4-羧酸甲酯(2)的制備
將1(7.8g,50.3mmol)加入30ml無水乙醇中，緩慢滴加80％水合肼(15.2ml,248.5mmol)，回流攪拌10h，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得黃色固體，產率65％。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):11.94(s,1h),7.57(s,1h),5.84(s,2h),3.67(s,3h).
吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸甲酯(3)的制備
將2(5.0g,35.4mmol)加入由20ml冰醋酸和5ml無水乙醇組成的混合溶液中，隨后滴加1,1,3,3-四甲氧基丙烷(6.4ml,38.9mmol)，加熱至90℃，反應10h，旋除乙醇，乙酸乙酯萃取，合并有機相，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得白色固體5.2g，產率83％。1hnmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.25(dd,j＝7.4,1.6hz,1h),8.83(dd,j＝7.5,1.5hz,1h),8.62(s,1h),7.14(t,j＝7.5hz,1h),3.95(s,3h).吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(4)的制備
將3(0.3g,1.7mmol)加入5ml乙醇中，隨后加入5ml水，加熱至50℃，緩慢滴加1ml的1mkoh溶液，反應3h，冷卻，在冰浴下滴加6m稀鹽酸將反應液ph值調至2，析出大量固體，抽濾，干燥，得黃色固體0.25g，產率91％。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):12.33(s,1h),9.39-9.16(m,1h),8.93-8.71(m,1h),8.69-8.49(m,1h),7.27(dt,j＝7.1,3.6hz,1h).
n-(5-硝基吡啶-2-基)乙酰胺(5a)的制備
將2-氨基-5-硝基吡啶(1.5g,10.8mmol)和三乙胺(2.2ml,15.9mmol)加入10ml無水二氯甲烷中，在冰浴條件下慢慢滴加乙酰氯(0.9ml,12.7mmol)，室溫下攪拌6h，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干，柱層析純化得黃色固體1.5g，產率77％。1hnmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.16(d,j＝2.7hz,1h),8.58-8.38(m,2h),8.26(s,1h),2.31(s,3h).
n-(5-氨基吡啶-2-基)乙酰胺(6a)的制備
將5a(1.0g,5.5mmol)加入10ml95％乙醇中，隨后加入鋅粉(3.6g,55.1mmol)和氯化銨(3.0g,56.1mmol)，并滴加2ml水，室溫下攪拌5h，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干，柱層析純化得灰白色固體0.7g，產率84％。1hnmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.33(d,j＝1.3hz,1h),8.26(d,j＝7.9hz,1h),7.74(s,1h),7.11(dd,j＝7.9,1.3hz,1h),3.50(s,2h),2.16(s,3h).
n-(6-乙酰氨基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-1)的制備
將4(0.1g,0.6mmol)加5ml氯化亞砜中，回流攪拌5h，旋干，溶于5ml無水二氯甲烷，滴加至溶有6a(0.09g,0.6mmol)和三乙胺(0.08ml,0.6mmol)的二氯甲烷中，室溫反應過夜，旋干，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干，柱層析純化得白色固體0.03g，產率17％。esi-ms:297.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.14(dd,j＝7.5,1.7hz,1h),8.98(dd,j＝7.5,1.5hz,1h),8.82(s,1h),8.60(d,j＝1.1hz,1h),8.47-8.39(m,1h),8.43(s,2h),7.78(s,1h),7.14(t,j＝7.5hz,1h),2.16(s,3h).
實施例2
n-(5-硝基吡啶-2-基)苯甲酰胺(5b)的制備
參照5a的制備方法，由2-氨基-5-硝基吡啶和丙酰氯反應得黃色固體，產率68％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.34(d,j＝1.1hz,1h),8.62-8.54(m,2h),8.20(s,1h),2.31(q,j＝8.0hz,2h),1.18(t,j＝8.0hz,3h).
n-(5-氨基吡啶-2-基)苯甲酰胺(6b)的制備
參照6a的制備方法，由5b反應得白色固體，產率69％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.02(d,j＝9.1hz,2h),7.72(d,j＝2.9hz,1h),7.06(dd,j＝8.9,2.9hz,1h),3.53(s,2h),2.38(q,j＝7.7hz,2h),0.85(t,j＝8.3hz,3h).
n-(6-丙酰氨基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-2)的制備
參照a-1的制備方法，由6b和4反應得白色固體，產率39％。esi-ms:311.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.44(s,1h),9.95(s,1h),9.47-9.31(m,1h),8.89(d,j＝4.5hz,1h),8.70(d,j＝11.9hz,2h),8.09(s,2h),7.34(dd,j＝6.9,4.2hz,1h),2.37(q,j＝7.5hz,2h),1.06(t,j＝7.5hz,3h).
實施例3
n-(5-硝基吡啶-2-基)環己烷甲酰胺(5c)的制備
將2-氨基-5-硝基吡啶(1.0g,7.2mmol)加至15ml吡啶中，在冰浴條件下慢慢滴加環己酰氯(0.9ml,7.2mmol)，室溫下攪拌6h，用稀鹽酸將反應溶液ph值調至5，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干，柱層析得黃色固體1.5g，產率78％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.36(s,1h),8.57(d,j＝7.9hz,1h),8.48(d,j＝8.0hz,1h),7.71(s,1h),2.56(s,1h),2.03-1.94(m,2h),1.72(dddd,j＝41.2,14.2,12.7,7.0hz,5h),1.49(q,j＝6.3,5.7hz,1h),1.44(dt,j＝13.8,6.4hz,1h),1.42-1.31(m,1h).
n-(5-氨基吡啶-2-基)環己烷甲酰胺(6c)的制備
參照6a的制備方法，由5c得白色固體，產率60％。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):8.35(s,1h),8.25(d,j＝7.9hz,1h),7.71(s,1h),7.02(d,j＝8.1hz,1h),3.50(s,2h),2.40(s,1h),2.09(dt,j＝13.1,6.9hz,2h),1.83(dt,j＝12.9,6.8hz,2h),1.73(ddt,j＝17.5,14.7,6.7hz,3h),1.54-1.35(m,3h).
n-(6-(環己烷甲酰氨基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-3)的制備
參照a-1的制備方法，由6c和4反應得白色固體，產率39％。esi-ms:365.0[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.83(s,1h),8.85(dd,j＝7.0,1.7hz,1h),8.79-8.72(m,2h),8.70(d,j＝2.6hz,1h),8.26(d,j＝8.9hz,1h),8.10(dd,j＝8.9,2.7hz,1h),7.96(s,1h),7.09(dd,j＝7.0,4.2hz,1h),2.27(tt,j＝11.6,3.4hz,1h),1.86(q,j＝3.4hz,8h),1.70(s,2h).
實施例4
n-(5-硝基吡啶-2-基)苯甲酰胺(5d)的制備
參照5a的制備方法，由2-氨基-5-硝基吡啶和苯甲酰氯反應得黃色固體，產率58％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.08-9.02(m,1h),8.64-8.41(m,2h),7.89(d,j＝7.5hz,2h),7.53(dt,j＝27.8,7.4hz,4h).
n-(5-氨基吡啶-2-基)苯甲酰胺(6d)的制備
參照6a的制備方法，由5d得灰白色固體，產率70％。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):10.33(s,1h),8.04-7.97(m,2h),7.86-7.74(m,2h),7.58-7.45(m,3h),7.04(dd,j＝8.8,2.9hz,1h),5.19(s,2h).
n-(6-苯甲酰氨基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-4)的制備
參照a-1的制備方法，由6d和4反應得淡黃色固體，產率25％。esi-ms:359.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.88(s,1h),8.97-8.82(m,2h),8.79-8.66(m,3h),8.20(dd,j＝9.1,2.6hz,1h),7.95(d,j＝7.4hz,2h),7.52(dt,j＝15.1,7.1hz,4h),7.09(dd,j＝7.0,4.2hz,1h).
實施例5
6-氯-3-硝基-2-(哌啶-1-基)吡啶(7a)的制備
將2,6-二氯-3-硝基吡啶(1.0g,5.2mmol)加入15ml無水乙醇中，在冰浴下慢慢滴加哌啶(0.6ml,6.1mmol)，室溫下攪拌4h，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得黃色固體1.0g，產率80％。1hnmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.08(d,j＝8.2hz,1h),6.64(d,j＝8.2hz,1h),3.43(d,j＝5.0hz,4h),1.71(d,j＝2.9hz,6h).
5-硝基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-胺(8)的制備
將7a(0.5g,2.1mmol)加入10ml氨水溶液中，80℃條件下封管反應12h，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得黃色固體0.4g，產率87％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.06(d,j＝8.8hz,1h),5.78(d,j＝8.8hz,1h),4.81(s,2h),3.30(t,j＝4.5hz,4h),1.59(s,6h).
n-(5-硝基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基)乙酰胺(9a)的制備
參照5c的制備方法，由8和乙酰氯反應得黃色固體，產率55％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.21(d,j＝8.5hz,1h),7.93(s,1h),7.64-7.39(m,1h),3.12-3.06(m,4h),2.23(s,3h),1.66-1.57(m,6h).
n-(5-氨基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基)乙酰胺(10a)的制備
參照6a的制備方法，由9a得灰白色固體，產率75％。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):7.83(d,j＝8.0hz,1h),7.71(s,1h),6.85(d,j＝8.0hz,1h),4.29(s,2h),3.12-3.06(m,4h),2.16(s,3h),1.66-1.57(m,6h).
n-(6-乙酰胺基-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-5)的制備
將4(0.1g,0.6mmol)加入5ml氯化亞砜中，回流攪拌5h，旋干，溶于5ml無水四氫呋喃，滴加至溶有10a(0.15g,0.6mmol)和k3po4(0.4g,1.9mmol)的四氫呋喃中，室溫反應過夜，旋干溶劑，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得灰白色固體0.05g，產率22％。esi-ms:380.2[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.19(s,1h),9.14-8.52(m,4h),7.91(d,j＝8.7hz,1h),7.71(s,1h),7.08(dd,j＝7.0,4.1hz,1h),3.02(t,j＝5.4hz,4h),2.21(s,3h),1.80(q,j＝5.7hz,4h),0.88(d,j＝7.8hz,2h).
實施例6
n-(5-硝基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基)乙酰胺(9b)的制備
參照5c的制備方法，由8和丙酰氯反應得黃色固體，產率63％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.10(d,j＝8.1hz,1h),8.01-7.92(m,2h),3.76-3.70(m,4h),2.31(q,j＝8.0hz,2h),1.65-1.56(m,6h),1.19(t,j＝8.0hz,3h).
n-(5-氨基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基)乙酰胺(10b)的制備
參照6a的制備方法，由9b得灰白色固體，產率72％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):7.72(d,j＝8.3hz,1h),7.53(s,1h),7.00(d,j＝8.3hz,1h),3.65(s,2h),3.04-2.95(m,4h),2.40(q,j＝7.6hz,2h),1.62(s,6h),0.90-0.84(m,3h).
n-(2-(哌啶-1-基)-6-丙酰胺基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-6)的制備
參照a-5的制備方法，由10b和4反應得淡黃色固體，產率38％。esi-ms:394.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.21(s,1h),8.88-8.83(m,1h),8.81(d,j＝2.6hz,1h),8.75(dd,j＝4.1,1.7hz,1h),7.95(d,j＝8.8hz,1h),7.65(s,1h),7.28(s,1h),7.09(dd,j＝7.1,4.1hz,1h),3.14-2.90(m,4h),2.45(q,j＝7.6hz,2h),1.81(d,j＝6.6hz,4h),1.27(s,3h),0.87(s,2h).
實施例7
n-(5-硝基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基)環己烷甲酰胺(9c)的制備
參照5c的制備方法，由8和環己烷甲酰氯反應得黃色固體，產率74％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.21(d,j＝8.9hz,1h),7.77(s,j＝7.9hz,1h),7.59(d,1h),3.73(s,4h),2.51(s,1h),1.95(dt,j＝13.3,6.8hz,2h),1.78(dt,j＝13.1,6.7hz,2h),1.70-1.56(m,8h),1.60-1.45(m,4h).
n-(5-氨基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基)環己烷甲酰胺(10c)的制備
參照6a的制備方法，由9c得灰色固體，產率75％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):7.74(d,j＝8.3hz,1h),7.61-7.53(m,1h),6.99(d,j＝8.3hz,1h),3.65(s,2h),2.99(t,j＝5.1hz,4h),2.22(td,j＝11.7,5.8hz,1h),1.97(d,j＝12.9hz,2h),1.75-1.64(m,6h),1.62-1.46(m,4h),1.28(d,j＝8.4hz,2h).
n-(6-(環己烷甲酰胺基)-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-7)的制備
參照a-5的制備方法，由10c和4反應得白色固體，產率28％。esi-ms:448.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.18(s,1h),8.86-8.80(m,1h),8.78(d,j＝2.1hz,1h),8.72(dd,j＝4.2,1.7hz,1h),7.94(d,j＝8.8hz,1h),7.64(s,1h),7.26(s,1h),7.06(dd,j＝7.0,4.1hz,1h),3.01(t,j＝5.3hz,4h),2.26(s,1h),2.11-1.87(m,6h),0.96-0.57(m,10h).
實施例8
n-(5-硝基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基)苯甲酰胺(9d)的制備
參照5c的制備方法，由8和苯甲酰氯反應得黃色固體，產率74％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.47(s,1h),8.27(dd,j＝8.8,1.8hz,1h),8.01-7.82(m,2h),7.74(dd,j＝8.9,1.8hz,1h),7.60-7.40(m,3h),3.37(t,j＝4.2hz,4h),1.67(s,6h).
n-(5-氨基-6-(哌啶-1-基)吡啶-2-基)苯甲酰胺(10d)的制備
參照6a的制備方法，由9d得灰色固體，產率65％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.28(s,1h),8.09-7.73(m,3h),7.70-7.39(m,3h),7.04(dd,j＝10.4,5.1hz,1h),5.45(s,2h),3.18-2.97(m,4h),1.60(s,6h).
n-(6-苯甲酰氨基-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-8)的制備
參照a-5的制備方法，由10d和4反應得白色固體，產率28％。esi-ms:442.2[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.38(s,1h),9.05-8.87(m,3h),8.50(s,1h),8.25(d,j＝8.7hz,1h),8.12-8.07(m,1h),8.01-7.93(m,2h),7.69-7.58(m,4h),3.19(t,j＝5.4hz,4h),1.40(s,6h).
實施例9
6-氯-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-胺(11a)的制備
參照6a的制備方法，由7a得灰色固體，產率78％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):6.85(d,j＝7.9hz,1h),6.57(d,j＝8.1hz,1h),4.28(s,2h),3.13-3.06(m,4h),1.67-1.57(m,6h).
n-(6-氯-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-9)的制備
參照a-5的制備方法，由11a和4反應得白色固體，產率36％。esi-ms:357.0[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.22(s,1h),8.86-8.75(m,2h),8.75-8.66(m,2h),7.11-6.96(m,2h),3.03(t,j＝5.4hz,4h),1.75(q,j＝5.5hz,4h),0.87(dt,j＝24.9,7.3hz,2h).
實施例10
1-(6-氯-3-硝基吡啶-2-基)哌啶-4-甲酰胺(7b)的制備
將2,6-二氯-3-硝基吡啶(1.0g,5.2mmol)和哌啶-4-甲酰胺(0.7g,5.5mmol)加入10ml無水乙醇中，在冰浴下慢慢加入碳酸鉀(0.7g,5.0mmol)，室溫下攪拌6h，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得黃色固體1.1g，產率74％。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):8.12(d,j＝8.3hz,1h),6.71(d,j＝8.3hz,1h),5.46(d,j＝32.0hz,2h),3.90(d,j＝13.6hz,2h),3.24-3.06(m,2h),2.57-2.37(m,1h),2.13-1.74(m,4h).
1-(3-氨基-6-氯吡啶-2-基)哌啶-4-甲酰胺(11b)的制備
參照6a的制備方法，由7b得灰色固體，產率58％。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):7.22(s,1h),6.92(d,j＝8.1hz,1h),6.76(d,j＝8.1hz,1h),6.69(s,1h),4.84(s,2h),3.32(s,4h),2.15(q,j＝7.3hz,1h),1.70(dd,j＝7.8,3.6hz,4h).
n-(2-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)-6-氯吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-10)的制備
參照a-5的制備方法，由11b和4反應得白色固體，產率25％。esi-ms:400.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.71(s,1h),9.40(dd,j＝4.3,1.7hz,1h),9.15(d,j＝8.5hz,1h),9.07-8.92(m,2h),7.46(s,2h),5.77(s,1h),5.55(s,1h),3.52(d,j＝11.7hz,2h),3.14(t,j＝11.4hz,2h),2.16(s,1h),1.64(q,j＝7.5hz,4h).
實施例11
2-(哌啶-1-基)吡啶-3-胺(12a)的制備
將7a(0.5g,2.1mmol)和10％鈀碳(0.2g,0.2mmol)加入10ml甲醇中，h2保護，室溫反應過夜，抽濾，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得灰白色固體0.3g，產率82％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):8.02(dd,j＝5.1,1.2hz,1h),6.78(dd,j＝8.0,1.3hz,1h),6.68(dd,j＝8.1,4.9hz,1h),4.58(s,2h),3.12-3.06(m,4h),1.67-1.57(m,6h).
n-(2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-11)的制備
參照a-5的制備方法，由12a和4反應得白色固體，產率35％。esi-ms:323.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.44(s,1h),8.87(dt,j＝7.9,1.8hz,2h),8.81(s,1h),8.78(dd,j＝4.2,1.8hz,1h),8.12(dd,j＝4.8,1.7hz,1h),7.20-7.02(m,2h),3.19-2.97(m,4h),1.84(p,j＝5.6hz,4h),1.27(q,j＝4.1hz,2h).
實施例12
1-(3-氨基吡啶-2-基)哌啶-4-甲酰胺(12b)的制備
參照12a的制備方法，由7b得灰色固體，產率62％。1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):7.53(s,1h),7.27(s,1h),6.92(s,1h),6.76(s,2h),4.75(s,2h),3.49(d,j＝49.5hz,4h),2.56(s,4h),2.21(s,1h).
n-(2-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-12)的制備
參照a-5的制備方法，由12b和4反應得白色固體，產率25％。esi-ms:366.0[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.66(s,1h),9.24(dd,j＝4.2,1.7hz,1h),9.00(dd,j＝8.1,1.7hz,1h),8.93-8.60(m,2h)，8.12(dd,j＝4.8,1.7hz,1h),7.15(dt,j＝8.1,4.6hz,2h),5.61(d,j＝6.0hz,1h),5.44(s,1h),3.35(d,j＝11.7hz,2h),2.97(t,j＝11.6hz,2h),2.38(s,1h),1.64(d,j＝7.2hz,4h).
實施例13
(z)-3-氨基-4,4,4-三氯-2-氰基丁-2-烯酸甲酯(13)的制備
將氰乙酸甲酯(4.5ml,50.9mmol)和三氯乙腈(9.6ml,95.7mmol)加至100ml無水乙醇中，在冰浴條件下慢慢滴加三乙胺(7.0ml,50.5mmol)，室溫下反應過夜，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得白色固體10.5g，產率85％。1hnmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):11.19(s,1h),8.26(s,1h),2.31(s,3h).
3,5-二氨基-1h-吡唑-4-羧酸甲酯(14)的制備
將13(5.0g,20.5mmol)加入40mldmf中，緩慢加入80％水合肼(3.1ml,51.1mmol)，加熱至100℃，反應10h，冷卻，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得白色固體1.5g，產率47％。1hnmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):11.52(s,1h),5.41(s,4h),3.65(td,j＝6.0,5.3,2.3hz,3h).
2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸甲酯(15)的制備
將14(5.0g,32.0mmol)加入20ml的2mhcl水溶液中，加熱至55℃，緩慢加入1,1,3,3-四甲氧基丙烷(4.8ml,29.1mmol)，反應4h，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干溶劑，柱層析純化得白色固體4.5g，產率73％。1hnmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.12(dd,j＝7.5,1.5hz,1h),9.00(dd,j＝7.5,1.5hz,1h),7.00(t,j＝7.5hz,1h),5.80(s,2h),3.95(s,3h).
2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(16)的制備
參照4的制備方法，由15反應得黃色固體，產率90％。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):12.05(s,1h),8.83(dd,j＝6.7,1.8hz,1h),8.47(dd,j＝4.4,1.8hz,1h),6.98(dd,j＝6.7,4.4hz,1h),6.39(s,2h).
n-(6-乙酰氨基吡啶-3-基)-2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-13)的制備
將16(0.1g,0.6mmol)和三乙胺(0.08ml,0.6mmol)加入5ml無水二氯甲烷中，緩慢滴加氯化亞砜(0.09ml,1.2mmol)，室溫下反應4h，旋干，溶于5ml無水四氫呋喃，滴加至溶有6a(0.09g,0.6mmol)和k3po4(0.4g,1.8mmol)的四氫呋喃中，室溫反應過夜，旋干，乙酸乙酯萃取，無水mgso4干燥，過濾，旋干，柱層析分離得白色固體0.04g，產率23％。esi-ms:297.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):9.08(dd,j＝7.5,1.5hz,1h),8.96(dd,j＝7.5,1.5hz,1h),8.85(s,1h),8.60(d,j＝1.1hz,1h),8.48-8.39(m,2h),7.78(s,1h),7.00(t,j＝7.5hz,1h),5.80(s,2h),2.16(s,3h).
實施例14
2-氨基-n-(6-(環己烷甲酰氨基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-14)的制備
參照a-13的制備方法，由16和6c反應得灰色固體，產率30％。esi-ms:469.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.71(s,1h),8.66(d,j＝2.5hz,1h),8.51(t,j＝4.6hz,2h),8.27(d,j＝8.9hz,1h),8.11(d,j＝9.0hz,1h),7.94(s,1h),6.89(s,1h),5.76(s,2h),2.27(d,j＝11.5hz,1h),2.01(d,j＝13.1hz,2h),1.86(s,2h),1.39-1.20(m,6h).
實施例15
2-氨基-n-(6-苯甲酰氨基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-15)的制備
參照a-13的制備方法，由16和6d反應得灰色固體，產率30％。esi-ms:469.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):9.77(s,1h),8.70(d,j＝10.2hz,2h),8.56-8.49(m,1h),8.45(d,j＝8.9hz,1h),8.20(d,j＝9.3hz,1h),7.97(d,j＝7.6hz,2h),7.55(dq,j＝15.1,8.0,7.5hz,4h),6.90(t,j＝5.6hz,1h),5.78(s,2h).
實施例16
n-(6-乙酰氨基-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)-2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-16)的制備
參照a-13的制備方法，由16和10a反應得灰色固體，產率30％。esi-ms:469.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.04(s,1h),8.73(d,j＝8.6hz,1h),8.58-8.43(m,2h),7.94-7.73(m,2h),6.87(dd,j＝6.7,4.4hz,1h),5.86(s,2h),3.01(t,j＝5.3hz,4h),2.21(s,3h),1.79(t,j＝5.6hz,4h),1.62(td,j＝7.0,6.5,3.1hz,2h).
實施例17
2-氨基-n-(6-(環己烷甲酰氨基)-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-17)的制備
參照a-13的制備方法，由16和10c反應得灰色固體，產率30％。esi-ms:469.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.06(s,1h),8.74(d,j＝8.7hz,1h),8.51(dt,j＝6.3,2.0hz,2h),7.94(d,j＝8.8hz,1h),7.68(s,1h),6.87(dd,j＝6.6,4.5hz,1h),5.84(s,2h),3.02(t,j＝5.4hz,4h),2.25(d,j＝11.9hz,1h),2.00(d,j＝12.9hz,2h),1.82(dt,j＝9.9,3.7hz,4h),1.64(d,j＝4.6hz,4h),1.54(d,j＝11.6hz,2h),1.39-1.26(m,4h).
實施例18
2-氨基-n-(6-苯甲酰氨基-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-18)的制備
參照a-13的制備方法，由16和10d反應得白色固體，產率30％。esi-ms:469.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.10(s,1h),8.82(d,j＝8.7hz,1h),8.51(d,j＝5.6hz,2h),8.35(s,1h),8.10(d,j＝8.7hz,1h),8.03-7.91(m,2h),7.66-7.47(m,3h),6.94-6.81(m,1h),5.83(s,2h),3.16-2.98(m,4h),1.81(d,j＝5.7hz,2h),1.65(s,4h).
實施例19
2-氨基-n-(6-氯-2-(哌啶-1-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-19)的制備
參照a-13的制備方法，由16和11a反應得白色固體，產率30％。esi-ms:469.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,chloroform-d):δ(ppm):10.12(s,1h),8.76(d,j＝8.4hz,1h),8.58-8.46(m,2h),7.05(d,j＝8.4hz,1h),6.96-6.85(m,1h),5.80(s,2h),3.14-3.05(m,4h),1.86-1.76(m,4h),1.65(d,j＝3.7hz,2h).
實施例20
2-氨基-n-(2-(4-氨基甲酰基哌啶-1-基)-6-氯吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(a-20)的制備
參照a-13的制備方法，由16和11b反應得白色固體，產率30％。esi-ms:469.1[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm):9.25(s,1h),9.17(ddd,j＝22.6,7.5,1.6hz,2h),8.41(d,j＝8.1hz,1h),7.00(t,j＝7.5hz,1h),6.91(d,j＝8.1hz,1h),5.80(d,j＝3.6hz,4h),4.31(dt,j＝12.6,7.1hz,2h),3.76(dt,j＝12.4,7.1hz,2h),2.54(p,j＝7.0hz,1h),2.17(dq,j＝14.0,7.1hz,2h),1.87-1.76(m,2h).
實施例21
irak4激酶活性測試
采用放射性同位素p33-atp標記方法檢測本發明化合物以及(r)-1-[3-[[5-(4-苯氧基苯甲酰基)-6-氨基嘧啶-4-基]氨基]哌啶-1-基]-2-丙烯-1-酮(化合物b)對btk激酶的抑制活性。放射性同位素檢測方法的靈敏度很高，測試結果非常準確，因此被認為是蛋白激酶生化活性檢測的“金標準”。
具體由reactionbiologycorp(malvempa)公司通過hotspot法測試。首先將8nm人類irak4激酶和肽底物在緩沖液中(20mmhepesph7.5,10mmmgcl2,1mmegta,0.02％brij35,0.02mg/mlbsa,0.1mmna3vo4,2mmdtt,1％dmso)室溫下混合，然后化合物溶解于指示劑量的100％dmso中(從10μm不斷稀釋3倍)并通過acoustic技術(echo550；nanoliterrange)遞送到激酶反應的混合液中，接著室溫下保持20min。隨后加入10μm的33p-atp(specificalactivity10μci/μl)，反應開始，監測反應120min。激酶活性通過filter-binding法測定，ic50值和曲線擬合由prism(graphpadsoftware)實現。
實驗結果如表1所示。其中符號“+++”表示化合物的ic50≤1μm；符號“++”表示化合物的1μm≤ic50≤10μm；符號“+”表示化合物的ic50＞10μm。
表1本發明化合物對irak4的抑制活性