本發(fā)明公開了一種苯甲酰胺類hedgehog抑制劑及其制備方法和應用，屬于醫(yī)藥化工技術領域。

背景技術：

hedgehog信號通路是一個經典的控制胚胎發(fā)育的信號轉導途徑，在胚胎發(fā)育和胚胎形成后細胞的生長和分化過程中都起著重要的作用。大量的證據表明，hedgehog信號通路的異常激活與腫瘤發(fā)生有關，例如基底細胞癌(bccs)、成神經管細胞瘤和一些實體腫瘤；此外，研究還發(fā)現hedgehog信號與癌癥干細胞存在某些關聯(lián)。因此，hedgehog信號通路已經成為抗癌藥物發(fā)現的有希望的靶點。

目前，人們已經開發(fā)出許多靶向hedgehog信號通路中關鍵組件蛋白smoothened的小分子抑制劑，其中一些抑制劑已經上市或處于臨床研究階段，包括vismodegib(gdc-0449)，sonidegib(nvp-lde-225)，taladegib(ly-2940680)，bms-833923(xl-139)。小分子抑制劑vismodegib(gdc-0449)已經于2012年被fda批準用于轉移基底細胞癌(bccs)的治療；由novartis開發(fā)的sonidegib(nvp-lde-225)于2015年被批準上市。

gdc-0449在治療癌癥的過程中產生了一定得耐藥性，例如smoothened受體d473h突變，因此需要開發(fā)新型的具有良好抑制活性的hedgehog抑制劑。

技術實現要素：

發(fā)明目的：針對上述技術問題，本發(fā)明提供了一種苯甲酰胺類hedgehog抑制劑及其制備方法和應用。

技術方案：本發(fā)明提供了一種苯甲酰胺類hedgehog抑制劑，所述抑制劑具有下述通式(i)所示的結構：

其中：

時，

時，

時，

本發(fā)明還提供了所述苯甲酰胺類hedgehog抑制劑的制備方法，反應過程如下：

由化合物制備化合物然后化合物d上的氨基與發(fā)生取代反應，最后與進行suziki偶聯(lián)反應，即得所述苯甲酰胺類hedgehog抑制劑。

優(yōu)選，由化合物a制備化合物d的反應過程如下：

優(yōu)選，由化合物a-1制備化合物d的反應過程如下：

本發(fā)明中，優(yōu)選的化合物具有下述化合物的結構：

上述優(yōu)選化合物制備過程如下：

首先，由化合物d上的氨基與發(fā)生取代反應，形成化合物d-5、d-6、d-7、d-8、d-9、d-10和d-11，然后再進行如下反應，即得：

本發(fā)明最后還提供了所述的苯甲酰胺類hedgehog抑制劑在制備hedgehog信號通路抑制藥物中的應用。

所述的苯甲酰胺類hedgehog抑制劑在制備治療hedgehog信號通路相關腫瘤藥物中的應用。所述hedgehog信號通路相關腫瘤為基底細胞癌(bccs)、成神經管細胞瘤、乳腺癌、結腸癌或肺癌等。

本發(fā)明的苯甲酰胺類hedgehog抑制劑，能夠較好的進入smoothened蛋白彎曲的結合腔內，特異性地靶向smoothened受體，同時能夠有效避免smoothened受體突變所引起的耐藥性，因此其對smoothened蛋白具有良好的相互作用，能夠有效抑制hedgehog信號通路，治療hedgehog信號通路異常激活的相關癌癥。

發(fā)明所述的化合物通過體外gli熒光素酶報告分析和體外抑制乳腺癌mcf-7細胞毒性實驗，顯示所述的化合物具有良好的hedgehog信號通路和乳腺癌mcf-7細胞抑制活性，可進一步研制開發(fā)為新型的hedgehog信號通路抑制劑和抗腫瘤藥物。

技術效果：相對于現有技術，本發(fā)明提供了一種新型的苯甲酰胺類化合物，其能夠特異性地靶向hedgehog信號通路中smoothened受體蛋白，有效避免smoothened受體突變所引起的耐藥性，從而能有效抑制hedgehog信號通路，以及有效治療hedgehog信號通路相關腫瘤，如基底細胞癌(bccs)、成神經管細胞瘤、乳腺癌、結腸癌或肺癌等。

具體實施方式

下面結合具體實例，進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領域技術人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。

本發(fā)明中，所采用的藥效學試驗方法，是本領域技術人員所熟知的方法；所采用的所有原料是本領域技術人員可通過市購的途徑所獲得的。

實施例1：合成目標化合物1，4-氟-n-甲基-n-(1-(4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氮雜萘-1-基)哌啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

首先，合成中間體d，反應過程如下：

1)合成中間體b：1-芐基-n-甲基哌啶-4-胺

將原料n-芐基哌啶酮(a，2.00g，10.57mmol，1.0eq.)溶解在30ml的甲醇中，向溶液中滴加4滴冰乙酸，攪拌均勻后加入0.79g(11.63mmol，1.1eq.)的甲胺鹽酸鹽，室溫(25℃)下反應2h；將反應移入冰水浴中，待反應溫度降至0℃后，分批加入1.33g(21.14mmol，2.0eq.)的氰基硼氫化鈉，分批加入時間控制在10min左右；攪拌均勻后將反應移出冰水浴，室溫下反應16h。反應結束后，將反應混合物倒入到飽和碳酸氫鈉溶液中，用二氯甲烷萃取三次，合并有機層，加入無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為二氯甲烷/2mnh3的甲醇溶液，體積比為20:1)得到無色油狀純產物b(1.88g，產率為87％)。

產物b的檢測數據如下：

¹hnmr(500mz,cdcl3)δ7.30-7.28(m,4h),7.25-7.21(m,1h),3.49(s,2h),2.83(d,j＝11.8hz,2h),2.41(s,3h),2.36-2.31(m,1h),2.02(t,j＝11.5hz,2h),1.84(d,j＝12.4hz,2h),1.40-1.33(m,3h)ppm；

mscalcdforc13h20n2[m+h]⁺:205.1705；found:205.1751。

2)合成中間體c：n-(1-芐基-4-哌啶基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物b(1.50g，7.34mmol，1.0eq.)溶解在30ml的二氯甲烷中，向溶液中加入2ml(14.43mmol，2.0eq.)的三乙胺，攪拌均勻后滴加1.66g(7.34mmol，1.0eq.)的4-氟-2-(三氟甲基)苯甲酰氯，室溫下反應6h；反應結束后，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為二氯甲烷/甲醇，體積比為20:1)得到無色油狀純產物c(2.72g，產率為94％)。

產物c的檢測數據如下：

¹hnmr(300mz,cdcl3)δ7.43-7.38(m,1h),7.32-7.22(m,7h),4.65-4.54(m,1h),3.40(s,2h),3.10-2.83(m,2h),2.65(s,3h),2.16(s,2h),1.93-1.58(m,4h)ppm；

mscalcdforc21h22f4n2o[m+h]⁺:395.1747；found:395.1808。

3)合成中間體d：4-氟-n-甲基-n-(4-哌啶基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物c(1.50g，3.81mmol，1.0eq.)溶解在30ml甲醇中，氮氣保護下向溶液中加入200mg的pd/c和2.40g(38.05mmol，10.0eq.)的甲酸銨，反應在50℃溫度下回流12h；反應結束后冷卻至室溫，過濾掉pd/c，濃縮濾液除去甲醇，加入二氯甲烷溶解殘留物，過濾掉甲酸銨，再濃縮濾液得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為二氯甲烷/2mnh3的甲醇溶液，體積比為20:1)得到白色固體d(1.05g，產率為91％)。

產物d的檢測數據如下：

mp:113℃；

¹hnmr(300mz,cdcl3)δ7.44-7.39(m,1h),7.32-7.29(m,2h),4.73-4.63(m,1h),3.21-3.05(m,2h),2.66(s,3h),2.41-2.27(m,2h),1.79-1.68(m,5h)ppm；

mscalcdforc14h16f4n2o[m+h]⁺:305.1277；found:305.1239。

中間體4還可以通過下面這條路線得到：

合成中間體c-1：叔丁基4-(4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺基)哌啶-1-甲酸酯

將原料叔丁基4-(甲氨基)哌啶-1-甲酸酯(a-1，2.00g，9.33mmol，1.0eq.)溶解在30ml的二氯甲烷中，向溶液中加入2ml(14.43mmol，1.5eq.)的三乙胺，攪拌均勻后滴加2.11g(9.33mmol，1.0eq.)的4-氟-2-(三氟甲基)苯甲酰氯，室溫下反應6h；反應結束后，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為二氯甲烷/甲醇，體積比為20:1)得到無色油狀目標化合物c-1(3.32g，產率為88％)。

合成中間體d：4-氟-n-甲基-n-(4-哌啶基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物c-1(3.00g，7.42mmol，1.0eq.)溶解在30ml二氯甲烷中，加入過量的2mhcl的乙醚溶液(10ml，20.00mmol，2.7eq.)，攪拌均勻后在室溫(25℃)下反應6h；反應結束后抽濾得到其鹽酸鹽，用二氯甲烷洗滌三次，將固體溶解于氫氧化鈉溶液中用二氯甲烷萃取三次，減壓濃縮得到白色固體d(2.05g，產率為91％)

4)合成中間體d-5：n-(1-(4-氯-1-酞嗪基)-4-哌啶基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物d(0.50g，1.64mmol，1.0eq.)溶解在30ml的1-甲基吡咯烷中，向溶液中加入0.45g(3.29mmol，2.0eq.)的碳酸鉀和0.36g(1.81mmol，1.1eq.)的1,4-二氯酞嗪，攪拌均勻后反應在80℃下回流12h；反應結束后冷卻至室溫，將反應混合物倒入到水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為石油醚/乙酸乙酯，體積比為1:1)得到白色固體d-5(0.56g，73％)。

產物d-5的檢測數據如下：

mp:86℃；

¹hnmr(300mz,cdcl3)δ8.22-8.19(m,1h),8.07-7.99(m,1h),7.92-7.89(m,2h),7.46-7.34(m,3h),4.93-4.85(m,1h),4.16-3.89(m,2h),3.50-3.19(m,2h),2.77(s,3h),2.26-2.04(m,2h),1.97-1.72(m,2h)ppm；

mscalcdforc22h19clf4n4o[m+h]⁺:467.1262；found:467.1289。

5)合成目標化合物1：4-氟-n-甲基-n-(1-(4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氮雜萘-1-基)哌啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物d-5(0.20g，0.43mmol，1.0eq.)溶解在18ml甲苯、6ml乙醇、6ml水組成的混合溶液中，向溶液中加入0.09g(0.86mmol，2.0eq.)的碳酸鈉和0.10g(0.47mmol，1.1eq.)的1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜戊硼烷-2-基)-1h-吡唑，用氮氣脫氣20min后加入60mg的四(三苯基膦)鈀，再用氮氣脫氣10min，攪拌均勻后反應在74℃下回流12h；反應結束后冷卻至室溫，加入二氯甲烷稀釋，用濃鹽水洗有機相三次，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為二氯甲烷/甲醇，體積比為30:1)得到黃色泡沫狀的目標化合物1(1.93g，產率為88％)。

目標化合物1的檢測數據如下：

¹hnmr(300mz,cdcl3)δ8.29-8.24(m,1h),8.12-8.04(m,1h),8.02-7.97(m,2h),7.85-7.82(m,2h),7.47-7.31(m,3h),4.94-4.86(m,1h),4.13-3.91(m,2h),4.03(s,3h),3.47-3.33(m,2h),2.76(s,3h),2.28-2.04(m,2h),1.96-1.70(m,2h)ppm；

mscalcdforc26h24f4n6o[m+h]⁺513.2026；found:513.2065.

目標化合物2和3的合成方法同目標化合物1。

實施例2：合成目標化合物4，n-(1-(4,5-二甲基-6-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)噠嗪-3-基)哌啶-4-基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

1)中間體d的合成同實施例1，合成中間體d-6：n-(1-(6-氯-4,5-二甲基-3-噠嗪基)-4-哌啶基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物d(0.50g，1.64mmol，1.0eq.)溶解在30ml的n-甲基吡咯烷酮中，向溶液中加入0.45g(3.29mmol，2.0eq.)的碳酸鉀和0.32g(1.81mmol，1.1eq.)的3,6-二氯-4,5-二甲基噠嗪，攪拌均勻后反應在110℃下回流12h；反應結束后冷卻至室溫，將反應混合物倒入到水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為石油醚/乙酸乙酯，體積比為1:1)得到白色固體d-6(0.57g，78％)。

中間體d-6的檢測數據如下：

mscalcdforc20h21clf4n4o[m+h]⁺445.1418；found:445.1438.

2)合成目標化合物4：n-(1-(4,5-二甲基-6-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)噠嗪-3-基)哌啶-4-基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物d-6(0.20g，0.45mmol，1.0eq.)溶解在18ml甲苯、6ml乙醇、6ml水組成的混合溶液中，向溶液中加入0.10g(0.90mmol，2.0eq.)的碳酸鈉和0.10g(0.49mmol，1.1eq.)的1-甲基-1h-吡唑-5-硼酸頻那醇酯，用氮氣脫氣20min后加入60mg的四(三苯基膦)鈀，再用氮氣脫氣10min，攪拌均勻后反應在74℃下回流12h；反應結束后冷卻至室溫，加入二氯甲烷稀釋，用濃鹽水洗有機相三次，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為二氯甲烷/甲醇，體積比為30:1)得到粉紅透明固體4(0.20g，產率為89％)。

目標化合物4的檢測數據如下：

¹hnmr(300mz,cdcl3)δ7.57-7.55(m,1h),7.47-7.40(m,1h),7.38-7.31(m,2h),6.36-6.34(m,1h),4.89-4.79(m,1h),3.92(s,3h),3.82-3.52(m,2h),3.40-3.22(m,2h),2.72(s,3h),2.30(s,3h),2.22(s,3h),2.09-2.00(m,2h),1.94-1.92(m,2h)ppm；

mscalcdforc24h26f4n6o[m+h]⁺491.2182；found:491.2236.

目標化合物5的合成方法同目標化合物4。

實施例3：合成目標化合物6，4-氟-n-甲基-n-(1-(4-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)喹唑啉-2-基)哌啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

1)中間體d的合成同實施例1和2，合成中間體d-7：n-(1-(4-氯-2-喹唑啉基)-4-哌啶基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物d(0.50g，1.64mmol，1.0eq.)溶解在30ml的t-buoh中，向溶液中加入1ml(7.21mmol，4.4eq.)的三乙胺和0.36g(1.81mmol，1.1eq.)的2,4-二氯喹唑啉，攪拌均勻后室溫(25℃)下反應12h；用二氯甲烷稀釋，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為石油醚/乙酸乙酯，體積比為1:1)得到白色固體d-7(0.62g，81％)。

中間體d-7的檢測數據如下：

mscalcdforc22h19clf4n4o[m+h]⁺467.1262；found:467.1269.

2)合成目標化合物6：n-(1-(4,5-二甲基-6-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)噠嗪-3-基)哌啶-4-基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺

將化合物d-7(0.20g，0.43mmol，1.0eq.)溶解在18ml甲苯、6ml乙醇、6ml水組成的混合溶液中，向溶液中加入0.09g(0.86mmol，2.0eq.)的碳酸鈉和0.10g(0.47mmol，1.1eq.)的1-甲基-1h-吡唑-5-硼酸頻哪酯，用氮氣脫氣20min后加入60mg的四(三苯基膦)鈀，再用氮氣脫氣10min，攪拌均勻后反應在74℃下回流12h；反應結束后冷卻至室溫，加入二氯甲烷稀釋，用濃鹽水洗有機相三次，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗產品，柱層析純化(洗脫液為二氯甲烷/甲醇，體積比為30:1)得到白色粉末狀目標化合物6(0.19g，產率為87％)。

目標化合物6的檢測數據如下：

¹hnmr(300mz,cdcl3)δ7.95-7.82(m,2h),7.79-7.73(m,1h),7.53(dd,j＝1.8and1.8hz,1h),7.50-7.42(m,2h),7.40-7.30(m,2h),7.09(dd,j＝2.1and1.8hz,1h),5.03-4.92(m,1h),4.70-4.37(m,2h),4.46(s,3h),3.55-3.32(m,2h),2.72(s,3h),2.26-1.85(m,2h),1.77-1.63(m,2h)ppm；

mscalcdforc26h24f4n6o[m+h]⁺513.2026；found:513.2059.

目標化合物7-20的合成方法同目標化合物6，其中在制備中間體d-8和d-9時分別同時生成中間體d-10和d-11。

實施例4：體外hedgehog信號通路抑制活性測試

體外gli熒光素酶報告分析：

1、將nih3t3細胞在含有10％fbs和1％青霉素-鏈霉素溶液的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)到足夠數量后，用lipo2000試劑將gli-fireflyluciferasereporter和tk-renillaluciferasereporter載體轉染至nih3t3細胞中。

2、將轉染有gli-fireflyluciferasereporter和tk-renillaluciferasereporter載體的nih3t3細胞接種到96孔板中(每孔1×10⁴個細胞，80μl培養(yǎng)基)，在5％co2、37℃下孵育過夜；

3、孵育后，向每孔中加入10μl的鼠源重組shh-n(在dmem培養(yǎng)基中，濃度為2.5μg/ml)和10μl的不同濃度的待測藥物(5個濃度，在dmem培養(yǎng)基中，含量為5-1000nm)使最終濃度達到8％fbs、0.25μg/ml的shh-n和0.5-100nm的待測化合物(5個復孔)，繼續(xù)培養(yǎng)48個小時；

4、設置對照組，即細胞分別在含有和不含0.25μg/mlshh-n的0.1％dmso的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為0％和100％的抑制活性對照；

5、培養(yǎng)完成后用pbs洗滌，利用雙熒光素酶報告檢測試劑盒檢測gli熒光素酶活性，并作為判斷hedgehog信號抑制活性的指標。

實施例5：體外乳腺癌mcf-7細胞增殖抑制活性測試

cck-8檢測細胞毒性實驗：1、將生長到一定濃度的mcf-7細胞消化后離心收集，用完全培養(yǎng)基制備成細胞懸液；并用細胞計數板計數，調整細胞懸液濃度，使細胞濃度約為5×10⁴/ml；

2、將上述調整好的細胞懸液接種到96孔板中，每孔約100μl，設5個復孔(n＝5)；

3、將上述接種mcf-7細胞的96孔板置于37℃的5％co2培養(yǎng)箱內孵育4h，至單層細胞鋪滿孔底；

4、用移液槍吸出96孔板中的培養(yǎng)基，向每孔中加入100μl用dmso溶解的并用完全培養(yǎng)基系列稀釋的不同濃度梯度的待測藥物，每個待測藥物均設5個濃度；同時設置調零孔(培養(yǎng)基和cck-8)和對照孔(培養(yǎng)基、mcf-7細胞、相同濃度的藥物溶解介質和cck-8)；

5、將加入待測藥物的96孔板置于37℃的5％co2培養(yǎng)箱內孵育16h；

6、向孵育后的96孔板中分別加入10μlcck-8，加完后輕輕敲擊96孔板使試劑混合均勻；

7、將加入cck-8的96孔板置于37℃的5％co2培養(yǎng)箱內孵育4h；

8、利用酶標儀測定450nm吸光度(od值)，檢測波長為450-490nm，參比波長為600-650nm。

結果表明(如表1所示)，本發(fā)明所述的化合物顯示出較好的hedgehog信號通路和乳腺癌mcf-7細胞抑制活性，其中目標化合物4和19對hedgehog信號通路和乳腺癌mcf-7細胞均具有較好的抑制活性，它們的ic50值與先導化合物ly-2940680相當甚至小于先導化合物。本發(fā)明的化合物可進一步研制開發(fā)為新型的hedgehog信號通路抑制劑和抗腫瘤藥物。

表1本發(fā)明化合物的hedgehog信號通路和乳腺癌mcf-7細胞的體外抑制活性結果