本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種P4HB基因表達(dá)的抑制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：傳統(tǒng)的醫(yī)藥領(lǐng)域，有機(jī)化合物和抗體是治療各類疾病的特效藥，而近年來，隨著分子生物學(xué)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用以及新的治療理念的提出，在生物體內(nèi)控制特定的基因表達(dá)的功能性核酸作為一種新型醫(yī)藥或診斷藥備受關(guān)注。目前，作為新型醫(yī)藥或診斷藥的功能性核酸主要有RNAi(RNAinterference：RNA干擾)，其藥物作用機(jī)理主要是RNAi的基因沉默，功能性RNA片段與轉(zhuǎn)錄因子等靶物質(zhì)特異性結(jié)合來抑制其功能的核酸適體，或與靶mRNA結(jié)合而抑制其翻譯的反義核酸，從而特異性地阻礙靶基因的mRNA前體中的多聚腺苷酸化而使其不穩(wěn)定化后，從而抑制靶基因的表達(dá)。具有轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達(dá)的功能性RNA片段的種類主要包括siRNA(smallinterferingRNA，小干擾RNA)、shRNA(shorthairpinRNA，短發(fā)夾RNA)及miRNA(microRNA，微小RNA)，從功能上，這些均被期待作為下一代的醫(yī)藥或診斷藥。但是肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一個較為復(fù)雜的過程，異常表達(dá)的基因成千上萬，目前還沒有找到一種在肝癌組織中起關(guān)鍵作用的基因，并且通過抑制該基因能夠遏制肝癌的發(fā)生或惡化。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種抑制P4HB基因表達(dá)的抑制劑siRNA，可以有效沉悶P4HB的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌組織的增長。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種P4HB基因表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑為具有SEQIDNo1所示核苷酸序列的siRNA分子。本發(fā)明還提供了所述抑制劑在制備預(yù)防或治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述的藥物包括連接有所述的抑制劑的重組載體。優(yōu)選的，所述重組載體的載體為聚乙烯亞胺。優(yōu)選的，所述siRNA分子與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:2～4。優(yōu)選的，所述藥物的劑型為注射劑。優(yōu)選的，所述的抑制劑通過下調(diào)P4HB基因表達(dá)，使細(xì)胞中GRP78表達(dá)量上調(diào)，以及抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明提供了一種P4HB基因表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑為具有SEQIDNo1所示核苷酸序列的siRNA分子。本發(fā)明提供的抑制劑，通過siRNA分子的核苷酸序列與P4HB基因表達(dá)產(chǎn)生的mRNA發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合，從而阻止靶位點P4HB基因的表達(dá)成蛋白質(zhì)，從而使P4HB基因沉默，達(dá)到抑制P4HB基因表達(dá)的目的。本發(fā)明還提供了所述抑制劑在制備預(yù)防或治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)P4HB在肝癌組織和細(xì)胞系中過度表達(dá)的特點，另外腫瘤P4HB水平與疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并與病人的存活率負(fù)相關(guān)，P4HB基因過表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長、遷移、侵襲。因此，本發(fā)明提供所述抑制劑與P4HB基因表達(dá)產(chǎn)生的mRNA發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合，使P4HB基因沉默，從而使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)能夠起到相反的作用。同時，P4HB沉默可以抑制肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤。進(jìn)一步的，本發(fā)明提供的應(yīng)用，通過所述抑制劑抑制P4HB基因表達(dá)使細(xì)胞中GRP78表達(dá)量上調(diào)，GRP78具有抑制肝癌細(xì)胞的EMT、遷移和侵襲的作用，同時能夠拮抗由P4HB過表達(dá)引起的肝癌細(xì)胞EMT、遷移和侵襲。附圖說明圖1為實施例1中肝癌細(xì)胞系與正常組織細(xì)胞中P4HB蛋白的表達(dá)量；圖2為實施例2中肝癌細(xì)胞系與正常組織細(xì)胞中P4HBmRNA的表達(dá)量；圖3為實施例3中MTT檢測細(xì)胞增殖情況；圖4為實施例4中qRT-PCR檢測P4HBmRNA表達(dá)量；圖5為實施例4中qRT-PCR檢測GRP78mRNA表達(dá)量。圖6為實施例4中P4HB和GRP78mRNA在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平相關(guān)性分析；圖7為實施例5中Westernblot檢測P4HB蛋白表達(dá)量；圖8為實施例5中Westernblot檢測上皮標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和波形蛋白的蛋白表達(dá)量；圖9為實施例5中Westernblot檢測上皮標(biāo)志物GRP78蛋白表達(dá)量；圖10為實施例6中Transwell技術(shù)檢測細(xì)胞遷移的情況圖片；圖11為實施例6中HepG2和Huh-7細(xì)胞經(jīng)處理后細(xì)胞遷移數(shù)量柱狀圖；圖12為實施例6中Transwell技術(shù)檢測細(xì)胞侵襲的情況圖片；圖13為實施例6中HepG2和Huh-7細(xì)胞經(jīng)處理后細(xì)胞侵襲數(shù)量柱狀圖；圖14為實施例7中免疫熒光分析E-cadherin的表達(dá)量圖片圖15為實施例7中免疫熒光分析波形蛋白的表達(dá)量圖片圖16為實施例8中不同處理的腫瘤圖片；圖17為實施例8中腫瘤體積的柱狀圖；圖18為實施例8中腫瘤重量的柱狀圖；圖19為實施例9中siRNA治療組腫瘤體積顯著低于載體PEI對照組和空白對照組；圖20為實施例9中siRNA組瘤體病理圖；圖21為實施例9中載體對照組瘤體病理圖；圖22為實施例9中空白對照組瘤體病理圖。具體實施方式本發(fā)明提供了一種P4HB基因表達(dá)的抑制劑，所述抑制劑為具有SEQIDNo1所示核苷酸序列的siRNA分子。本發(fā)明中，所述抑制劑的核苷酸序列優(yōu)選利用siRNA靶點尋找工具“siRNAfinder”(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder)根據(jù)P4HB基因的mRNA(GeneBankaccessionno.AF015950)的開放可讀框內(nèi)的靶向特定序列設(shè)計而成。所述的siRNA序列在合成前優(yōu)選進(jìn)行BLAST檢索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，侯選siRNA序列在美國NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的Unigene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對。當(dāng)siRNA序列只同源于靶基因時，才可以用于下一步的基因功能研究。本發(fā)明對所述siRNA分子的合成沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的siRNA分子合成方法即可。本發(fā)明實施例中所述siRNA分子是由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司根據(jù)本發(fā)明提供的序列合成得到。本發(fā)明還提供了所述抑制劑在制備預(yù)防或治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中，所述的藥物包括連接有所述的抑制劑的重組載體。本發(fā)明對所述重組載體的載體優(yōu)選為聚乙烯亞胺(PEI)。所述聚乙烯亞胺的分子量優(yōu)選為700～1000Da，更優(yōu)選為800Da。本發(fā)明對聚乙烯亞胺的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的聚乙烯亞胺即可。本發(fā)明中，所述siRNA分子與聚乙烯亞胺的摩爾比優(yōu)選為1:2～4，更優(yōu)選為1:3。本發(fā)明中，所述藥物的劑型為注射劑。所述注射劑中抑制劑的濃度優(yōu)選為80～120mg/ml，更優(yōu)選為100mg/ml。本發(fā)明中所述注射劑還包括注射劑可接受輔料。所述輔料優(yōu)選包括緩沖液、分散劑、助懸劑、穩(wěn)定劑、防腐劑和抗氧化劑中的一種或多種。所述注射劑的溶劑為注射用水。本發(fā)明中，所述緩沖液的用量優(yōu)選以調(diào)節(jié)體系的pH值在5.0～8.0為準(zhǔn)；所述的緩沖液優(yōu)選為枸櫞酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明中，所述防腐劑在注射劑中的質(zhì)量濃度優(yōu)選為：0.02％～0.2％(w/v)，更優(yōu)選為0.1～0.15％，最優(yōu)選為0.12％；所述的防腐劑為尼泊金甲酯鈉、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯中的一種。本發(fā)明中，所述分散劑在注射劑中的質(zhì)量百分含量優(yōu)選為0.5％～15％(w/v)，更優(yōu)選為1％～10％，最優(yōu)選為5％；所述的分散劑優(yōu)選為聚乙烯吡咯烷酮；本發(fā)明中，所述助懸劑在注射劑中的質(zhì)量百分含量優(yōu)選為0.2％～20％(w/v)，更優(yōu)選為0.5％～15％，最優(yōu)選為10％；所述的助懸劑優(yōu)選為羧甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；本發(fā)明中，所述穩(wěn)定劑在注射劑中的質(zhì)量百分含量優(yōu)選為0.01％～0.2％(w/v)，更優(yōu)選為0.08～0.15％，最優(yōu)選為0.08％；所述穩(wěn)定劑的種類為RNAstable(R)穩(wěn)定劑。所述RNAstable(R)穩(wěn)定劑購自Qiagen.德國。本發(fā)明中，所述抗氧化劑在注射劑中的質(zhì)量百分含量優(yōu)選為0.02％～0.5％(w/v)，更優(yōu)選為0.08～0.3％，最優(yōu)選為0.15％；所述的抗氧化劑優(yōu)選為連二亞硫酸鈉。本發(fā)明中，所述的抑制劑通過下調(diào)P4HB基因表達(dá)，使細(xì)胞中GRP78表達(dá)量上調(diào)，抑制上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明中，所述抑制劑抑制肝癌細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移和侵襲，并且還能抑制腫瘤的形成。所述肝癌細(xì)胞包括Huh-7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、PLC5細(xì)胞、Hep3B細(xì)胞、SK-Hep-1細(xì)胞。本發(fā)明中，所述注射劑的使用方法優(yōu)選1次/3日，每次注射0.1ml/Kg。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種P4HB基因表達(dá)的抑制劑及其應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實施例1將人肝癌細(xì)胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞系，用含100U/ml雙抗，10％胎牛血清的DMEM全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)48h，培養(yǎng)環(huán)境為：37℃、5％CO2、100％濕度；約2d換液一次，每天采用顯微鏡觀察細(xì)胞的增殖數(shù)量，當(dāng)細(xì)胞呈對數(shù)期增長時，采用Westernblot方法分別檢測各細(xì)胞系P4HB的表達(dá)量：具體步驟如下：①細(xì)胞準(zhǔn)備細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，Westernblot法檢測各組細(xì)胞蛋白量的表達(dá)情況；②相關(guān)液體配制A.2MTris-HCl(pH8.8)100m1稱取24.2gTris堿；加50mlddH2O；緩慢加濃鹽酸至pH8.8(約4m1)；讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，加ddH2O至100ml。B.1MTris-HCl(pH6.8)100m1稱取12.1gTris堿；加50mlddH2O至pH6.8(約8ml)，讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，加ddH2O至總量為100ml。C.50％甘油100ml取50m1100％甘油；加入50mlddH2O。D.1％溴酚藍(lán)10ml稱取100mg溴酚藍(lán)；加ddH2O至l0ml，攪拌直到完全溶解；過濾除去聚合的染料。E.lmol/LDTT儲存液用l0ml0.0lmol/L乙酸鈉溶液(pH5.2)溶解1.545gDTT，過濾除菌后-20℃保存。F.丙烯酰胺儲存液100ml30％(W/V)丙烯酰胺，0.8％(W/V)雙丙烯酰胺。29.2g丙烯酰胺；0.8g雙丙烯酰胺(戴手套通風(fēng)柜操作，加ddH2O至100ml，緩慢攪拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，石蠟?zāi)し饪?，過濾后于4℃避光保存。G.10％SDS10gSDS于100ml純水中，緩緩攪拌使其完全溶解，室溫保存。H.電泳緩沖液稱取3.0gTris，甘氨酸14.4g，溶于900ml純水中，充分混勻，溶解后加入10％SDS10ml，定容至1000ml，混勻后室溫保存。轉(zhuǎn)移緩沖液稱取Tris2.4g，甘氨酸11.5g，溶于700ml純水中，充分溶解后，加入甲醇200ml，定容到1000ml，室溫保存。J.RIPA裂解液50mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，1％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，溶解混勻后于4℃保存?zhèn)溆茫R用前加入蛋白酶抑制劑(cocktail，1000×)至所需濃度。K.0.01％考馬斯亮藍(lán)染液10mg考馬斯亮藍(lán)R2500.25g，先加入10ml冰醋酸酸，45ml無水乙醇，攪拌至充分溶解后，定容至100ml，過濾后于4℃避光保存。L.TTBS洗滌液100ml10×TBS+900mlddH2O+1mlTween-20。M.麗春紅染液麗春紅0.025g冰醋酸50m1ddH2O5m1N.脫色液甲醇45m1冰醋酸l0mlddH2O45m1O.5×Samplebuffer(pH調(diào)為6.8，在調(diào)pH后再加溴酚藍(lán)、甘油)③蛋白樣品的制備A.將用于細(xì)胞裂解的所有物品及液體放入0℃冰盒預(yù)冷。B.按照碧云天生產(chǎn)Western及IP細(xì)胞裂解液說明書配制細(xì)胞裂解液。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)min內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。C.將24孔板中的培養(yǎng)基倒掉，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞三遍，每孔加入裂解液100u1，用槍吹打數(shù)下，使細(xì)胞裂解液與細(xì)胞充分接觸，然后放于裝滿碎冰的大托盤中，冰育40min，并放在搖床上不停搖動。D.將細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，放入超低溫高速離心機(jī)離心，條件為：4℃、14000g，5min，吸取上清液至干凈無菌1.5ml離心管中；E.用nanodrop1000測定蛋白濃度，單位為mg/ml值，標(biāo)注好，-80℃低溫冰箱保存。F.將上清轉(zhuǎn)移至另-EP管中，-20℃保存。④SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-polyacrylamidegeleletrophoresis，SDS-PAGE)SDS-PAGE凝膠配制根據(jù)碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制說明書配制10％分離膠(下層膠)，5％濃縮膠(上層膠)。a.10％分離膠配制：按表1進(jìn)行配制。表1SDS-PAGE凝膠分離膠加樣表按上述表格所列加入15ml離心管后，振蕩器充分混勻，用1000ul加樣槍沿兩層玻璃板間隙內(nèi)緩慢注入5ml，用雙蒸水封膠，室溫下聚合60min，當(dāng)膠凝固后，吸取上層雙蒸水，并盡可能用濾紙吸干。b.5％濃縮膠配制：按表2進(jìn)行配制。表2SDS-PAGE凝膠濃縮膠加樣表振蕩器充分混勻，用1000ul加樣槍注入兩側(cè)玻璃板間隙，并迅速插入梳子，室溫下聚合約30min，拔出梳子，以備電泳。樣品處理分別取各組同等質(zhì)量蛋白樣本，稀釋至等體積，98℃水浴鍋中5min，使蛋白變性，冷卻后加入碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液3ul。上樣與電泳上樣：冷卻到室溫后，用10ul微量加樣器把蛋白樣品緩慢加入加樣孔，每孔約10ul。并加彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)約5ul。電泳：上層濃縮膠條件為：100V，30min；下層分離膠為：200V，30min，待樣品中的溴酚藍(lán)遷移至膠的底端附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳，本實驗觀察到綠色蛋白條帶出現(xiàn)并拉開距離即可停止電泳。⑤轉(zhuǎn)膜(Transfer)本實驗選用PVDF膜，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。具體步驟如下：A.戴上干凈手套，切割以目的蛋白所在為中心區(qū)域大小約4cm×2.5cm矩形PVDF膜，分離凝膠與PVDF膜，并在PVDF膜右上角剪一小三角，標(biāo)示為膜的蛋白面，并浸泡事先準(zhǔn)備好的預(yù)冷轉(zhuǎn)膜液中。B.剪6張濾紙及一張PVDF膜，其大小與凝膠大小一致，泡入轉(zhuǎn)膜液中10min，注意PVDF膜事先需甲醇浸濕，且不能超過15s，再移至轉(zhuǎn)膜液中。C.在轉(zhuǎn)膜板中按照從陰極到陽極順序依次放：三層濾紙，凝膠，PVDF膜，三層濾紙，并保證各層之間無氣泡。D.轉(zhuǎn)模板放入轉(zhuǎn)膜電泳槽中電泳，恒定電流300mA，60min。注意，轉(zhuǎn)膜電泳槽裝置需放入冰浴中進(jìn)行，對抗轉(zhuǎn)移時產(chǎn)熱。⑥染色(Staining)轉(zhuǎn)膜后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，觀察蛋白的殘留情況?；蛘哂名惔杭t染色液對PVDF膜進(jìn)行染色觀察轉(zhuǎn)膜的效果。TTBS溶液漂洗2-3次，每次3-5min，去除麗春紅或考馬斯亮藍(lán)，進(jìn)行后續(xù)的Western檢測。⑦封閉(Blocking)把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，洗滌3遍，每遍5min，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。加入封閉液，并放入4℃冰箱封閉過夜。注意整個過程PVDF膜不能干燥，并使液體完全覆蓋蛋白膜。⑧孵育(Incubation)一抗孵育(Primaryantibodyincubation)次日下午用TBST洗滌三次，每次5min，加入兔抗人β-Actin單克隆抗體(工作濃度為1：5000)，封閉放入4℃冰箱過夜。二抗孵育(Secondaryantibodyincubation)隔夜回收一抗，用TTBS洗滌3次，每次5min，吸盡洗滌液，加入Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(工作濃度為1：1000)，室溫下在側(cè)擺搖床上搖動孵育60min?；厥斩?。用TTBS洗滌4次，每次5min。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。⑨目的蛋白檢測(Detectionofproteins)A.BeyoECLPlus工作液的配制：等體積混合50ulBeyoECLPlusA液和B液，室溫放置備用。工作液宜在臨檢測前配制。B.Western二抗孵育后，并進(jìn)行數(shù)次洗滌后，用平頭鑷將膜取出，用吸水紙略吸去過多的液體(切勿接觸膜的蛋白面)，然后置于一潔凈保鮮膜上。C.根據(jù)膜的大小，按每10平方厘米膜加1mlBeyoECLPlus工作液的比例，滴加BeyoECLPlus工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上，放置1-2min。D.取膜，棄BeyoECLPlus工作液，用吸水紙吸去過多的液體。將膜放在兩片保鮮膜中間，隨后進(jìn)行壓片檢測或熒光成像儀檢測。E.壓片檢測：將膜固定于片夾內(nèi)。暗室內(nèi)壓片1min，立即顯影定影，根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時間?；蛑苯臃謩e壓片30s，1，3，5min，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。F.熒光成像儀檢測：將膜放置到KodakImagestation2000MM熒光成像儀內(nèi)，參考儀器說明書進(jìn)行檢測。采用儀器自帶軟件KodakMolecularImagingSoftwareStandardEditionV5.0.1.30分析結(jié)合的抗體，并采用光密度分析進(jìn)行量化。各細(xì)胞系的P4HB的表達(dá)量如圖1所示。圖1為Westernblot檢測P4HB蛋白在肝癌細(xì)胞系包括Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B，和SK-Hep-1與正常組織中的表達(dá)量；由圖1可以看出，人肝癌細(xì)胞Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B和SK-Hep-1中P4HB的表達(dá)量明顯高于正常干細(xì)胞L02細(xì)胞系中P4HB的表達(dá)量，P4HB在肝癌細(xì)胞中呈上調(diào)表達(dá)，說明P4HB的表達(dá)與肝癌的發(fā)生有直接聯(lián)系。實施例2將人肝癌細(xì)胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞收集，試劑盒法提取RNA，提取的RNA調(diào)整濃度后進(jìn)行PCR檢測。P4HB基因的PCR正向引物為：5’-GGAATGGAGACACGGCTTC-3’；P4HB的PCR反向引物：5’-TTCAGCCAGTTCACGATGTC-3’。所述PCR的反應(yīng)程序如表3所示。表3PCR的反應(yīng)程序qRT-PCR后得到人肝癌細(xì)胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞系的P4HB基因的表達(dá)情況如圖2所示。由圖2可以看出，以正常組織中P4HB基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)，肝癌細(xì)胞Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B和SK-Hep-1細(xì)胞的P4HB的mRNA的表達(dá)量明顯高于正常組織中P4HB基因的表達(dá)量。實施例3將P4HBsiRNA與載體lipofectamineTM2000的連接是物理連接，通過lipofectameTM2000帶有的正電荷將帶有負(fù)電荷的siRNA物理包封在lipofectamnie內(nèi)的。siRNA與lipofectamine混勻后，即實現(xiàn)了物理接連。用P4HB抑制劑siRNA分子、對照siRNA、P4HB載體和空載體分別轉(zhuǎn)染HepG2和Huh-7細(xì)胞24小時。得到處理后的HepG2和Huh-7細(xì)胞。具體采用商品化的載體lipofectaminTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟如下：先將裝有1OD(3.0nmol)siRNA的干粉的Ep管在臺式離心機(jī)上瞬時離心4s，然后緩慢打開管蓋，溶解時加入150ulDEPC處理水后蓋上蓋子，震蕩溶解，使其siRNA終濃度為20uM。為避免多次凍溶，將其分裝入0.1mlEP管，每管約15ul，標(biāo)注種類、日期，放入-80℃冰箱備用。準(zhǔn)備工作：首先向準(zhǔn)備好的Ep管內(nèi)分別加入150ul左右的opti-MEM培養(yǎng)基；接著分別加入6ul的siRNA和對照組siRNA；然后將36ulLipofectamineTM2000和900ulopti-MEM混勻后的混合液，將混合液靜置5min，分別取出150ul混合液加入到含siRNA和對照組siRNA管內(nèi)，然后混勻，靜置20min；轉(zhuǎn)染：分別在制備的lipofectamine-saRNA溶液中取100ul加入到對應(yīng)的Huh-7、HepG2細(xì)胞孔中，例如從siRNA管分別取出100ul(共三次)加入到siRNA組各孔細(xì)胞中，以此類推到對照組的管，最終每孔中siRNA的濃度約為80nM。換液：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6h，棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌2次，每孔加入500μl的DMEM全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞接種于24孔板，每孔2×104個細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。在不同時間點(12h、24h、48h和72h)，去除培養(yǎng)基，采用MTT試劑盒分析細(xì)胞相對活性，加樣后，用分光光度計在550nm波長下測量每孔細(xì)胞的OD值。MTT檢測細(xì)胞增殖情況如圖3所示。由圖3可以看出，P4HBsiRNA組細(xì)胞相對系對細(xì)胞數(shù)顯著低于兩個對照組(對照siRNA組、對照載體組)，說明通過siRNA下調(diào)P4HB表達(dá)水平，可抑制細(xì)胞增殖。P4HB組細(xì)胞相對數(shù)量最高，說明，通過向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染P4HB基因，上調(diào)P4HB表達(dá)水平，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。實施例4對實施例3處理得到的HepG2和Huh-7細(xì)胞檢測P4HB和GRP78基因進(jìn)行qRT-PCR檢測。分別提取肝癌細(xì)胞的總RNA，分別取1ugRNA采用Moloneymurineleukemiavirus(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，然后根據(jù)SYBRGreenreactionmix(AppliedBiosystems,USA)操作指南進(jìn)行加樣，在型號為anABIPrism7900HT熒光定量PCR儀進(jìn)行實時熒光定量PCR。P4HB的PCR正向引物為：5’-GGAATGGAGACACGGCTTC-3’；P4HB的PCR反向引物：5’-TTCAGCCAGTTCACGATGTC-3’。GRP78的PCR正向引物為：5’-GCCTGTATTTCTAGACCTGCC-3’；GRP78的PCR反向引物5’-TTCATCTTGCCAGCCAGTTG-3’；以β-actin基因作為內(nèi)參基因；所述β-actin基因的PCR正向引物為：5’-AGCGCGGCTACAGCTTCA-3’；所述β-actin基因的PCR反向引物為5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’。PCR體系擴(kuò)增的程序如表4所示。表4PCR體系擴(kuò)增的程序qRT-PCR檢測P4HBmRNA表達(dá)量如圖4所示；qRT-PCR檢測GRP78mRNA表達(dá)量如圖5所示。圖6為P4HB和GRP78mRNA在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平相關(guān)性分析。由圖4可知，P4HBsiRNA可顯著下調(diào)P4HB基因表達(dá)水平，P4HBsiRNA組P4HBmRNA相對表達(dá)水平顯著高于對照siRNA組(controlsiRNA)，P4HB載體組(向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染P4HB基因)的P4HBmRNA表達(dá)水平顯著高于載體對照組(controlvector組)。說明可通過轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)P4HB表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染P4HB上調(diào)P4HB表達(dá)水平。由圖5和圖6可知，P4HB基因表達(dá)水平與GRP78基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。下調(diào)P4HB基因表達(dá)水平，GRP78基因表達(dá)水平升高，上調(diào)P4HB基因表達(dá)水平，GRP78基因表達(dá)水平下降。實施例5針對實施例3處理得到的肝癌組織HepG2和Huh-7細(xì)胞，分別提取P4HB蛋白、GRP78、E-鈣粘素、N-鈣粘素、波形蛋白和β-actin蛋白進(jìn)行Westernblot分析。將HepG2和Huh-7細(xì)胞樣本放入在RIPA裂解液，存于-80℃，待用。HepG2和Huh-7細(xì)胞經(jīng)PBS洗去培養(yǎng)基后，采用含有全蛋白酶抑制劑的裂解液。然后每個樣本分別取20ug總蛋白，進(jìn)行加樣，分析采用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后分別與抗P4HB、抗GRP78、抗E-鈣粘素、抗N-鈣粘素、抗波形蛋白、抗β-actin蛋白在4℃過夜孵育，之后，PBS洗去液體，采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1小時。采用VersaDoc5000密度儀測量PVDF膜上蛋白條帶的密度，進(jìn)一步量化分析。圖7為Westernblot檢測P4HB蛋白表達(dá)量，圖8為Westernblot檢測上皮標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和波形蛋白的蛋白表達(dá)量，圖9為Westernblot檢測上皮標(biāo)志物GRP78蛋白表達(dá)量。由圖7可知，P4HBsiRNA可顯著下調(diào)P4HB蛋白表達(dá)水平，P4HBsiRNA組P4HB蛋白相對表達(dá)水平顯著高于對照siRNA組(controlsiRNA)，P4HB載體組(向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染P4HB基因)的P4HB蛋白表達(dá)水平顯著高于載體對照組(controlvector組)。說明可通過轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)P4HB蛋白表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染P4HB上調(diào)P4HB蛋白表達(dá)水平。由圖9可知，P4HB蛋白表達(dá)水平與GRP78蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。下調(diào)P4HB蛋白表達(dá)水平，GRP78蛋白表達(dá)水平升高，上調(diào)P4HB蛋白表達(dá)水平，GRP78蛋白表達(dá)水平下降。由圖8可知，下調(diào)P4HB表達(dá)水平(P4HBsiRNA組)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平相對對照組(controlsiRNA組)升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平相對對照組(controlsiRNA組)下降；上調(diào)P4HB表達(dá)水平(P4HBvector組)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平相對對照組(controlsiRNA組)下降，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平相對對照組(controlsiRNA組)升高。E-cadherin蛋白表達(dá)降低、N-cadherin和Vimentin蛋白升高是腫瘤細(xì)胞EMT過程的表現(xiàn)，EMT是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲力、耐藥、輻射抵抗的重要因素。因此，說明可通過下調(diào)P4HB表達(dá)水平，降低腫瘤EMT，從而降低腫瘤的惡性表現(xiàn)。實施例6細(xì)胞遷移和侵襲力分析采用8um膜的Transwell室分析細(xì)胞遷移和侵襲能力。遷移能力：將1×105個細(xì)胞加到不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，然后加到Transwell室上部，Transwell室下部加滿生長培養(yǎng)基。24小時，刮去室上部的細(xì)胞，遷移到室下部的細(xì)胞進(jìn)行固定，用0.1％濃度的結(jié)晶紫染色，成像。分析侵襲能力：Transwell室的膜上覆蓋一層基質(zhì)膠(Matrigel)，余方法同遷移能力方法。圖10為Transwell技術(shù)檢測細(xì)胞遷移的情況圖片；圖11為HepG2和Huh-7細(xì)胞經(jīng)處理后細(xì)胞遷移數(shù)量柱狀圖。圖12為Transwell技術(shù)檢測細(xì)胞侵襲的情況圖片；圖13為HepG2和Huh-7細(xì)胞經(jīng)處理后細(xì)胞侵襲數(shù)量柱狀圖。由圖10～13的結(jié)果說明通過P4HBsiRNA下調(diào)P4HB表達(dá)水平，可降低腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力。實施例7轉(zhuǎn)染后的各組(P4HBsiRNA組、controlsiRNA組、P4HBvector組和controlvector組)細(xì)胞接種于2-井室的細(xì)胞培養(yǎng)玻片上，24h后，各組細(xì)胞內(nèi)分別加入抗-E-candherin或抗-vimentin抗體，在4℃孵育12h后，用PBS洗去抗體，然后加入FITC連接的二抗，室溫孵育1h，去培養(yǎng)液，用DAPI染色，然后用SP2MP共聚焦顯微鏡觀察、拍照、分析。圖14和圖15分別為免疫熒光分析E-cadherin和波形蛋白的表達(dá)量圖片。實施例8將裸鼠分成兩組，其中一組在裸鼠的右側(cè)皮下種植含有抑制劑siRNA重組載體轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞，種植5×106個細(xì)胞/只；另一組小鼠在相同部位注射相同劑量的對照siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞。將兩組裸鼠在相同的環(huán)境條件下飼養(yǎng)37天，分別從兩組裸鼠體內(nèi)取出腫瘤組織。測量腫瘤體積，稱量腫瘤重量，并做記錄。圖16為腫瘤圖片；對不同處理得到的裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生的腫瘤體積情況如圖17所示；不同處理得到的裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生的腫瘤重量如圖18所示。由圖16～17可知，通過siRNA下調(diào)P4HB表達(dá)水平的瘤細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)后，發(fā)展為瘤組織的體積、重量均顯著低于對照組。說明該siRNA可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。實施例9將P4HB抑制劑與PEI、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸鹽緩沖液、羧甲基纖維素鈉、連二亞硫酸鈉和注射用水配置成注射劑，注射劑中P4HB抑制劑的終濃度為100mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量濃度為5％，連二亞硫酸鈉0.15％，注射劑的pH值為6.8。移植瘤長徑大小約0.5cm的肝細(xì)胞癌移植瘤裸鼠作為研究對象，進(jìn)行靜脈注射小鼠，按照每千克小鼠注射10ml的注射液，每三天注射一次。實驗組為5只，對照組分為PEI載體對照組和空白對照組(生理鹽水注射)，均為同批移植瘤裸鼠，載體對照組注射同等體積的載體PEI溶液，空白對照組注射同等體積的生理鹽水。結(jié)果如圖19和圖20所示。圖19顯示siRNA治療組腫瘤體積顯著低于載體PEI對照組和空白對照組(生理鹽水組)。說明以PEI為載體的siRNA通過靜脈注射，可以顯著抑制腫瘤的增長。圖20為siRNA組瘤體病理圖。由圖20可知，圖片中有可見片狀壞死紅染(如黑色箭頭所示處)，其他部分瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊、核固縮、核染色變深、核仁邊界不清。載體對照組和空白對照組病理圖如圖21和圖22所示。由圖21和22中可知，圖片中可見瘤細(xì)胞呈增殖狀態(tài)(如灰色箭頭所示處)，壞死較少。圖20～圖22經(jīng)過比較，說明siRNA可促使腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞壞死，抑制腫瘤組織發(fā)生發(fā)展。由以上實施例可知，本發(fā)明設(shè)計合成的靶向P4HB的siRNA，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞系，然后通過RT-PCR和westernblot分別檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)靶基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果說明本研究設(shè)計的siRNA可以有效沉默P4HB的表達(dá)，進(jìn)一步負(fù)向調(diào)控肝癌的EMT過程，及抑制肝癌組織的增長。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
：的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>上海市第七人民醫(yī)院<120>一種P4HB基因表達(dá)的抑制劑及其應(yīng)用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>1aagatgaactgtaatacgcaa21當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3