本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及三十烷醇作為COX-2和VEGF抑制劑，以及在制藥及保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：三十烷醇，分子式為C30H62O，結(jié)構(gòu)式為CH3-(CH2)28-CH2-OH，CAS號(hào)：593-50-0。三十烷醇主要來(lái)源于米糠蠟、蜂蠟、甘蔗中，農(nóng)業(yè)上作為廣譜性植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑。但在醫(yī)藥應(yīng)用中，除古巴、美國(guó)以二十八烷醇為主要成分開發(fā)的保健品外，有關(guān)三十烷醇的報(bào)道很少。G.Thippeswamy等發(fā)表的文章“OctacosanolisolatedfromTinosporacordifoliadownregulatesVEGFgeneexpressionbyinhibitingnucleartranslocationofNF-<kappa>BanditsDNAbindingactivity”表明，二十八烷醇可抑制內(nèi)皮細(xì)胞和艾氏腹水癌細(xì)胞增殖、雞胚絨毛尿囊膜和大鼠角膜血管新生以及癌性腹水的分泌，其機(jī)制與二十八烷醇抑制腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)有關(guān)，但是關(guān)于三十烷醇并沒有相關(guān)的報(bào)道。有關(guān)三十烷醇在藥物中的應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)枮镃N200710066112.7的中國(guó)專利公開了三十烷醇在制備治療高血脂疾病中的應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)枮镃N200610048846.8、CN200910146061.8的中國(guó)專利公開了三十烷醇對(duì)肝癌、腸癌、肺癌等具有不同程度的療效，但其作用機(jī)制和靶點(diǎn)尚不明確。目前尚未檢索到關(guān)于三十烷醇作為COX-2和VEGF抑制劑的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種COX-2和VEGF抑制劑。本發(fā)明的另一目的是提供三十烷醇作為COX-2和VEGF抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明所述的COX-2和VEGF抑制劑由重量百分比5-95％的三十烷醇和余量的藥用輔料組成。由于三十烷醇為單一活性成分，藥用輔料僅只是作為賦型劑，所以三十烷醇在其中含量并不是重要的因素，只要能成藥即可，一般為10-50％。所述的藥用輔料為常用藥用輔料，如：聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉中的一種或兩種。三十烷醇也可以與其它藥用成分如環(huán)磷酰胺配伍，作為COX-2和VEGF的抑制劑。三十烷醇的加入可以大大降低環(huán)磷酰胺的副作用。具體見后面的試驗(yàn)。本發(fā)明涉及三十烷醇為單一活性成分或者與其它藥用成分配合作為制備COX-2和VEGF抑制劑的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及三十烷醇為單一活性成分或者與其它藥用成分配合作為制備COX-2和VEGF抑制劑的保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)三十烷醇具有抑制COX-2和VEGF的活性，通過(guò)抑制COX-2和VEGF的活性可以達(dá)到阻止癌細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移的作用。COX-2(環(huán)氧合酶-2)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤新生血管形成等機(jī)制，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，COX-2已成為腫瘤的一個(gè)重要的治療靶分子。COX-2的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤組織中微血管的生成。作用于COX-2抑制劑的昔布類可用于預(yù)防和治療腫瘤，美國(guó)FDA在1999年批準(zhǔn)昔布類抗炎藥用于人家族性腺瘤性息肉(FAP)輔助治療，但其嚴(yán)重心血管副作用限制了它的應(yīng)用，默克公司的羅非昔布已撤出市場(chǎng)。作用于VEGF抑制劑的貝伐單抗在2004年2月26日獲得FDA的批準(zhǔn)，是美國(guó)第一個(gè)獲得批準(zhǔn)上市的抑制腫瘤血管生成的藥。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)又稱血管滲透性因子(VPF)，是血管生長(zhǎng)因子中具有高度特異的促新生血管形成作用的因子，是COX-2促血管形成作用的最重要的相關(guān)因子，在腫瘤血管新生的過(guò)程中起著重要的作用，是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中很重要的因素。COX-2可能通過(guò)PGs途徑上調(diào)VEGF的表達(dá)，從而參與腫瘤組織中新生血管的生成，這可能是COX-2促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的機(jī)制。癌癥免疫治療是癌癥治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，位于2013年《科學(xué)》十大突破之首。自然殺傷(NK)細(xì)胞是一群不同于T、B淋巴細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞，屬于一類獨(dú)立的淋巴細(xì)胞。該細(xì)胞群是抗腫瘤的第一道防線，無(wú)需抗原預(yù)先致敏即可直接識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，能發(fā)揮特異性殺傷靶細(xì)胞的作用，尤其是對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有快速殺傷和溶解的作用。本發(fā)明闡明了三十烷醇通過(guò)選擇性抑制COX-2和VEGF，發(fā)揮抗腫瘤作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示：三十烷醇可以通過(guò)選擇性抑制COX-2發(fā)揮抗腫瘤作用，通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)發(fā)揮抗新生血管生成的作用。同時(shí)，三十烷醇能夠提高機(jī)體免疫功能，劑量依賴性的激活小鼠NK細(xì)胞的活性，同時(shí)能明顯促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖和溶血素抗體的生成，拮抗環(huán)磷酰胺所致的白細(xì)胞數(shù)降低的作用。本發(fā)明揭示了三十烷醇作為單一活性成分或者與其它藥用成分配合作為制備COX-2和VEGF抑制劑的藥品和保健品中的應(yīng)用。可以制成片劑、顆粒劑、硬膠囊、軟膠囊、干混懸劑、凍干粉針劑、口服液、滴丸或口腔速崩片。三十烷醇作為單一活性成分其有效劑量范圍為5mg-2000mg。藥效學(xué)試驗(yàn)：1：三十烷醇對(duì)裸鼠COX-2表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)備：5％CO2孵箱、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)、離心機(jī)、電冰箱、超低溫冰箱、無(wú)菌細(xì)胞間、超純水系統(tǒng)、液氮罐。主要試劑：臺(tái)盼藍(lán)、Tween-80(產(chǎn)品編號(hào)：T8360)、羧甲基纖維素鈉(產(chǎn)品編號(hào)：C8621)、胎牛血清(南美血源，產(chǎn)品編號(hào)：FBS-12A-100)、胰蛋白酶(貨品編號(hào)：M0043)、RPMI-1640培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)：C11875500bt，GIBCO)、PBS、三十烷醇(昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20140716)、塞來(lái)昔布(產(chǎn)品編號(hào)：169590-42-5，武漢勝天宇生物科技有限公司)、免疫組化試劑盒:兔免疫組化試劑盒(編號(hào)：PV-9001，北京中杉金橋)、DABKIT3ml(產(chǎn)品編號(hào)：ZLI-9018，北京中杉金橋)；RabbitantiCOX-1/Cyclooxygenase-1Polyclonalantibody(產(chǎn)品編號(hào)：13393-1-AP，Proteintech)、COX-2環(huán)氧化物酶(產(chǎn)品編號(hào)：ZA-0515，北京中杉金橋)。主要材料：人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送)；4～6周齡BALB/c雌性裸鼠30只(體重15-20g)，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004)。主要試劑的配制：受試化合物配制方法：0.5％羧甲基纖維素鈉：精確稱取羧甲基纖維素鈉500mg加入煮沸的蒸餾水100ml，不斷攪拌，直至液體澄清，常溫靜置一夜。三十烷醇劑量設(shè)置：高劑量組：精確稱取200mg三十烷醇加入吐溫-801ml充分?jǐn)嚢杌靹颍尤?.5％羧甲基纖維素鈉12.3ml，充分?jǐn)嚢柚敝脸示鶆蛞恢碌幕鞈乙?3.3ml，濃度為15mg/ml。中劑量組：精確稱取200mg三十烷醇加入吐溫-801ml充分?jǐn)嚢杌靹颍尤?.5％羧甲基纖維素鈉25.7ml，充分?jǐn)嚢柚敝脸示鶆蛞恢碌幕鞈乙?6.7ml，濃度為7.5mg/ml。低劑量組：精確稱取200mg三十烷醇加入吐溫-801ml充分?jǐn)嚢杌靹颍尤?.5％羧甲基纖維素52.3ml，充分?jǐn)嚢柚敝脸示鶆蛞恢碌幕鞈乙?3.3ml，濃度為3.75mg/ml。陽(yáng)性對(duì)照藥物塞來(lái)昔布的配制：精確稱取200mg塞來(lái)昔布粉末，加入吐溫-801ml充分?jǐn)嚢杌靹颍尤?.5％羧甲基纖維素鈉25.7ml，充分?jǐn)嚢柚敝脸示鶆蛞恢碌幕鞈乙?6.7ml，濃度為7.5mg/ml。實(shí)驗(yàn)步驟：三十烷醇對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響細(xì)胞培養(yǎng)及移植瘤模型的建立：用培養(yǎng)基懸浮，取10μl細(xì)胞懸液，加入臺(tái)盼藍(lán)10μl，細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)活細(xì)胞。10mlPBS洗細(xì)胞，1000r/min，3min，3次。用不含血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度使每0.2ml細(xì)胞懸液含3×106個(gè)細(xì)胞。4-6周齡雌性裸鼠，體重15-20g，無(wú)菌條件下，以1ml注射器再次將細(xì)胞懸液混勻，抽取細(xì)胞懸液0.2ml，排盡空氣備用。于擬成瘤點(diǎn)靠近尾端0.5-1cm處進(jìn)針，緩慢將細(xì)胞懸液注入，共30只。種瘤后密切觀察，待裸鼠成瘤后記錄裸鼠體重和瘤體大小，觀察裸鼠生長(zhǎng)狀況。種瘤后第10天裸鼠移植瘤成瘤率100％。待裸鼠移植瘤大小約50-100mm3，30只裸鼠分成5個(gè)小組，每組6只灌胃：三十烷醇低劑量組(37.5mg/kg.d)、中劑量組(75mg/kg.d)、高劑量組(150mg/kg.d)、塞來(lái)昔布組(75mg/kg.d)、空白對(duì)照組(生理鹽水組)，每日1次。給藥4周后頸椎脫位法處死裸鼠，取腫瘤組織。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，然后計(jì)算以下指標(biāo)：體積：V＝ab2/2；抑瘤率＝[(V對(duì)照組-V實(shí)驗(yàn)組)/V對(duì)照組]×100％。移植瘤標(biāo)本的處理及免疫組化檢測(cè)COX-1和COX-2的表達(dá)：移植瘤與正常組織分界清楚，呈魚肉狀、質(zhì)軟、易碎，PBS清洗，逐個(gè)編號(hào)后一部分放入標(biāo)本管中，于液氮中保存。一部分于4％多聚甲醛中固定24-48h。標(biāo)本充分固定后脫水、透明、包埋、切片以進(jìn)一步處理。切片后行HE染色及按PV-9001免疫組化(Biotin-StrePtavidinHRPDetectionSystems)及ZLI-9018DABKit的操作步驟進(jìn)行COX-1(抗體濃度1:200)、COX-2(抗體濃度1：200)的免疫組織化學(xué)染色。采用ImageProPlus軟件測(cè)量各組高倍鏡圖片的平均OD值(總OD值/Area)。統(tǒng)計(jì)方法：采用IBMSPSSStatistics22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)腫瘤大小和各組400倍圖片的平均OD值(總OD值/Area)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用Post-hoc(LSD)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：三十烷醇對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響(表1)。表1各組裸鼠體積(mean±SDmm3)及抑瘤率％的表達(dá)組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組塞來(lái)昔布組裸鼠n66666體積799±430458±227656±221429±262729±289抑瘤率(％)42.6817.9046.30*8.76三十烷醇高劑量組與對(duì)照組比較，其腫瘤生長(zhǎng)顯著減慢，抑瘤率46.30％，*(P<0.05)。各組移植瘤COX-1、COX-2表達(dá)的比較(表2)。HE染色各組鏡下均可見中間大片壞死組織，壞死邊緣可見散在的炎癥細(xì)胞，壞死組織邊緣部分為未壞死的腫瘤組織。光鏡下移植瘤細(xì)胞排列失去正常結(jié)構(gòu)，細(xì)胞密集分布，細(xì)胞核藍(lán)染，核質(zhì)比例明顯增大，細(xì)胞異型性顯著。COX-1和COX-2染色，胞質(zhì)中可見棕色或者黃色染色區(qū)域，為陽(yáng)性染色。表2各組免疫組化的平均OD值用(mean±SD)表示對(duì)COX-1的免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行光密度值測(cè)定，方差分析顯示，與對(duì)照組相比，各組COX-1的表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)COX-2的免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行光密度值測(cè)定，方差分析顯示(表2)，與對(duì)照組相比，塞來(lái)昔布組、低劑量組、中劑量組、高劑量組COX-2的表達(dá)均顯著減低，*(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：與對(duì)照組比較，高劑量組三十烷醇對(duì)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)有顯著抑制作用。三十烷醇各劑量組及塞來(lái)昔布組對(duì)HT-29裸鼠移植瘤COX-2的表達(dá)有抑制作用，但對(duì)COX-1的表達(dá)無(wú)抑制作用。三十烷醇與COX-2的相互作用模式預(yù)測(cè)，利用花生四烯酸與COX-2的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)1CVU，分子對(duì)接三十烷醇與COX-2的可能的結(jié)合模式(有兩種)并與花生四烯酸的結(jié)合模式比較，結(jié)論是兩者的結(jié)合模式非常相似，三十烷醇也可能是COX-2的抑制劑。2：三十烷醇抑制LOVO結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備：同上。主要實(shí)驗(yàn)試劑：同上。塞來(lái)昔布膠囊(西樂堡)(產(chǎn)品批號(hào)：M72189；分包裝批號(hào)：N07162)、免疫組化試劑盒：兔免疫組化試劑盒(編號(hào)：SP-9001，北京中杉金橋)、VEGFAntibody50ul(產(chǎn)品編號(hào)：19003-1-AP，proteintech)；PTGS2Rabbitpolyclonalantibody50ul(產(chǎn)品編號(hào)：12375-1-AP，proteintech)、HE染色試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：M2314)、1％戊巴比妥鈉。主要試劑的配制：同上。其中塞來(lái)昔布濃度為6mg/ml。主要材料：人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞株(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送)；4～6周齡BALB/c雌性裸鼠50只(體重15-20g)，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004)。實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)：取凍存管，快速放入37℃溫水中，輕輕搖動(dòng)令其快速融化，待剩下黃豆大小時(shí)拿出，使余熱將其融化。取出15ml離心管一只，預(yù)先加入5mlDMEM/F12完全培養(yǎng)基,1000r/min離心，3min，去上清液。取上述LOVO細(xì)胞加入1mlDMEM/F12完全培養(yǎng)基混勻，移入培養(yǎng)瓶中，加入4ml培養(yǎng)基補(bǔ)齊，放入CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時(shí)需換夜，換液時(shí)間1天，傳代時(shí)間為3天，按1:3的比例傳。用LOVO細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型：用培養(yǎng)基懸浮，取10μl細(xì)胞懸液，加入臺(tái)盼藍(lán)10μl，細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。10mlPBS洗細(xì)胞，1000r/min，3min，3次。用不含血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度使每0.2ml細(xì)胞懸液含3×106個(gè)細(xì)胞。4-6周齡雌性裸鼠，體重15-20g，無(wú)菌條件下，以1ml注射器再次將細(xì)胞懸液混勻，抽取細(xì)胞懸液0.2ml，于擬成瘤點(diǎn)靠近尾端0.5-1cm處進(jìn)針，緩慢將細(xì)胞懸液注入，拔針，碘伏棉簽壓迫進(jìn)針點(diǎn)2min，共50只。種瘤后第10-14天裸鼠移植瘤成瘤率80％。裸鼠背部種瘤處出現(xiàn)球形、橢圓形、不規(guī)則的包塊，邊界清楚，質(zhì)地較周圍正常組織韌。種瘤后18日，將腫瘤平均體積為50-100mm3的35只裸鼠平均分為5組：三十烷醇高劑量組(150mg/kg.d)、中劑量組(75mg/kg.d)、低劑量組(37.5mg/kg.d)、塞來(lái)昔布組(60mg/kg.d)、空白對(duì)照組(生理鹽水組)。分別按照劑量要求進(jìn)行灌胃，每次灌胃體積為0.2ml，每日1次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束計(jì)算腫瘤體積和抑瘤率。移植瘤標(biāo)本處理：0.2ml的1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠，頸椎脫臼法將裸鼠處死，取出移植瘤，多聚甲醛固定的組織通過(guò)脫水、透明、浸蠟和包埋等步驟制成石蠟包埋塊。切片后HE染色，按SP-9001SPlinkDetectionKits(Biotin-StreptavidinHRPDetectionSystems)及ZLI-9018DABKit的操作步驟進(jìn)行VEGF(抗體濃度1:200)的免疫組織化學(xué)染色。統(tǒng)計(jì)方法：同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：三十烷醇對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響。低劑量組、中劑量組、高劑量組、塞來(lái)昔布組的抑瘤率分別為33.33％、52.05％、70.77％、61.60％。與對(duì)照組比較，低劑量組移植瘤體積無(wú)顯著性差異(P>0.05)。中劑量組、高劑量組、塞來(lái)昔布組與對(duì)照組比較，其移植瘤生長(zhǎng)顯著減慢，*P<0.05，見表3。表3治療結(jié)束后裸鼠腫瘤體積大小(mean±SDmm3)及其抑瘤率％組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組塞來(lái)昔布組裸鼠n77777體積mm31047±647698±448502±304306±237402±215抑瘤率％-33.3352.05*70.77*61.60*裸鼠肝臟：將裸鼠處死后，觀察肝臟，可見肝臟上有大小不等的灰白色結(jié)節(jié)，對(duì)照組肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較大，數(shù)目很多，4只幾乎布滿肝臟，3只靠近肝臟邊緣結(jié)節(jié)數(shù)目多，近中央結(jié)節(jié)數(shù)目較少，無(wú)法計(jì)數(shù)。低劑量組肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較多，有2只裸鼠肝臟布滿結(jié)節(jié)，2只近肝臟邊緣結(jié)節(jié)數(shù)目較多，無(wú)法計(jì)數(shù)，余下3只平均結(jié)節(jié)數(shù)目為5-10個(gè)。中劑量組和塞來(lái)昔布組肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較小，平均為2-7個(gè)/只。高劑量組肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較小，2只未見到結(jié)節(jié)，余下5只平均為2-3個(gè)/只。移植瘤及肝的HE染色：各組腫瘤組織于顯微鏡下均可見中間大片壞死組織，壞死邊緣可見散在的炎癥細(xì)胞，壞死組織邊緣部分為未壞死的腫瘤組織。光鏡下移植瘤細(xì)胞排列失去正常結(jié)構(gòu)，雜亂排列，細(xì)胞密集分布或排成腺管狀，細(xì)胞核藍(lán)染，核質(zhì)比例明顯增大，細(xì)胞異型性顯著。各組肝組織于顯微鏡下觀察可見肝臟組織中出現(xiàn)不同于正常肝組織的形態(tài)不規(guī)則的團(tuán)塊狀或片狀細(xì)胞，細(xì)胞異型性較大，核漿比例大，細(xì)胞核大小不一。移植瘤VEGF的免疫組化結(jié)果：VEGF免疫組化分布范圍較廣，胞質(zhì)、胞核和間質(zhì)均有表達(dá)。對(duì)VEGF的免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行光密度值測(cè)定，方差分析顯示，與對(duì)照組相比，小劑量組VEGF的表達(dá)降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，塞來(lái)昔布組、中劑量組、高劑量組VEGF的表達(dá)均顯著減低，*P<0.05，見表4。表4各組VEGF免疫組化圖片的平均OD值用mean±SD表示組別樣本量(n)平均IOD空白對(duì)照組70.10750±0.06755低劑量組70.07556±0.03401中劑量組70.04782±0.02808*高劑量組70.03952±0.02121*塞來(lái)昔布組70.05301±0.04789*實(shí)驗(yàn)結(jié)論：和陰性對(duì)照組相比，不同劑量組三十烷醇對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。高劑量組和中劑量組三十烷醇對(duì)LOVO細(xì)胞裸鼠移植瘤VEGF的表達(dá)有抑制作用，可抑制結(jié)腸癌裸鼠肝轉(zhuǎn)移。3：三十烷醇對(duì)移植于裸鼠的人體腫瘤胃癌MNK-45的療效實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料：吐溫80、0.5％CMC-Na、生理鹽水。環(huán)磷酰胺(CTX)，江蘇恒瑞制藥有限公司，批號(hào)：11030921，以生理鹽水溶解。瘤源：由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評(píng)價(jià)研究中心傳代維持。瘤源：由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評(píng)價(jià)研究中心傳代維持，將體外的細(xì)胞株轉(zhuǎn)化至免疫缺陷裸小鼠體內(nèi)傳代待生長(zhǎng)至第二代后使用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：裸小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003。裸小鼠為6周齡。雌雄皆可，每次使用同一性別小鼠。動(dòng)物數(shù)：試驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組裸小鼠每組6只，陰性對(duì)照組為12只。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：裸小鼠置于層流架中SPF條件飼養(yǎng)，所應(yīng)用的飼料、墊料、籠具及接觸的器械等均應(yīng)高壓消毒后使用。實(shí)驗(yàn)主要步驟：無(wú)菌條件下取體內(nèi)生長(zhǎng)旺盛的人體腫瘤第2代后異種移植模型為瘤源，制備成瘤塊，于裸小鼠右腋皮下接種約2mm3/鼠，次日隨機(jī)分組，待腫瘤觸及約為100mm3開始給藥，每隔3-5天動(dòng)態(tài)測(cè)試各組荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)的大小及荷瘤鼠體重，用卡尺測(cè)量荷瘤鼠腫瘤的短徑(a)及長(zhǎng)徑(b)，按(a2×b)/2公式計(jì)算腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)約四周左右處死各組動(dòng)物，剖取的腫瘤稱重按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率：腫瘤抑制率％＝[(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重]×100％合并用藥的效應(yīng)根據(jù)金氏公式計(jì)算Q值：Q＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)Ea+b為合并用藥的抑瘤率，Ea和Eb分別為A藥和B藥的抑瘤率。如Q值0.85-1.15為相加(+)，﹥1.15為增強(qiáng)(++)。表5三十烷醇對(duì)人胃癌MKN-45裸鼠異種移植模型抗腫瘤療效與溶劑對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。表6三十烷醇合并環(huán)磷酰胺對(duì)人胃癌MKN-45裸鼠異種移植模型抗腫瘤療效與溶劑對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。4：三十烷醇對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及NK細(xì)胞活性的影響三十烷醇配制方法：精確稱取所需樣品，以少量吐溫80助溶后逐漸加入0.5％CMCNa溶液待充分混勻后稀釋至所需濃度即可。給藥體積為0.5ml/20g鼠。實(shí)驗(yàn)材料：吐溫80、0.5％CMC-Na。香菇多糖，武漢迪奧藥業(yè)有限公司，批號(hào)20100202。DMEM完全培養(yǎng)基，內(nèi)含10％新生牛血清(GIBCOBRL)、巰基乙醇、HEPES等。3H-TdR:放射性濃度：1mci/ml，購(gòu)自上海原子核研究所。刀豆蛋白A：50μg/ml，購(gòu)自Sigma公司。YAC-1細(xì)胞：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評(píng)價(jià)研究中心傳代維持。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：品系：C57BL/6(SPF級(jí))，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005，體重為18-20g/6周齡。性別：雄性。動(dòng)物數(shù)：試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組每組10只。實(shí)驗(yàn)方法：NK細(xì)胞活性的測(cè)定：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分組，每組10只，按劑量連續(xù)給藥兩周，最后一次給藥結(jié)束后處死小鼠，無(wú)菌條件下取脾臟，置于小容器中，用手術(shù)剪刀將脾臟剪碎，分離細(xì)胞，經(jīng)幾次自然沉降分離脾細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，將脾細(xì)胞調(diào)整至1×106/ml，加入100μl到96孔板中作為效應(yīng)細(xì)胞。另取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的YAC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，作為靶細(xì)胞，以靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞之比為1:100的濃度加在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，同時(shí)加入0.5μci/孔的3H-TdR同位素。每組設(shè)置10個(gè)復(fù)孔，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用多頭細(xì)胞器收集細(xì)胞，在液閃儀上測(cè)定CPM值，計(jì)算特異性抑制百分率(Pi)表示NK細(xì)胞活性。其中Pi＝1-(實(shí)驗(yàn)組摻入CPM值/對(duì)照組摻入CPM值)×100％。小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分組，每組10只，按劑量連續(xù)給藥兩周，最后一次給藥結(jié)束后處死小鼠，無(wú)菌條件下取脾臟，置于小容器中，用手術(shù)剪刀將脾臟剪碎，分離細(xì)胞，經(jīng)幾次自然沉降分離脾細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，將脾細(xì)胞調(diào)整至1×107/ml，在無(wú)菌的96孔培養(yǎng)板中加入脾細(xì)胞100μl，同時(shí)加入1mg/ml的刀豆蛋白A50ul，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后加入0.5μci/孔的3H-TdR同位素，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。該實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置10個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組用培養(yǎng)基代替脾細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后在多孔細(xì)胞收集器中收集細(xì)胞，5％TCA固定，無(wú)水乙醇脫水，液閃儀上測(cè)定CPM值。結(jié)果表明，三十烷醇樣品能夠劑量依賴性的激活小鼠NK細(xì)胞的活性，同時(shí)也能夠明顯促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。詳見表7～8。表7三十烷醇對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。表8三十烷醇對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響組別CPM值Pi(％)三十烷醇高劑量組6856±939.3**66三十烷醇中劑量組6890.2±602.8**65三十烷醇低劑量組9759.8±648.0**51香菇多糖6276.4±559.5**68對(duì)照19919.9±622.8與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。5：三十烷醇對(duì)小鼠溶血素的影響實(shí)驗(yàn)材料：昆明種小鼠，雄性，18-20g，由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。實(shí)驗(yàn)劑量：實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)為：150mg/kg，75mg/kg，37.5mg/kg。陽(yáng)性藥：香菇多糖，批號(hào)：20100202，生產(chǎn)單位：武漢迪奧藥業(yè)有限公司。實(shí)驗(yàn)劑量：50g/kg。給藥途徑及容量：灌胃給藥，0.5ml/20g。實(shí)驗(yàn)方法：小鼠隨機(jī)分組，三十烷醇高、中、低各3個(gè)劑量組，陽(yáng)性藥組，空白模型組。每組10只。雞紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，配成5％混懸液即可，補(bǔ)體以2只豚鼠血清混合，用生理鹽水配成10％濃度。每鼠腹腔注射5％生理鹽水雞紅細(xì)胞混懸液0.2ml進(jìn)行免疫，同時(shí)開始給藥，免疫后7日，最后一次給藥1h摘眼球取血，離心，取血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清1ml，與5％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml、10％補(bǔ)體0.5ml混合，37℃恒溫箱保溫30min后，置0℃冰箱中中止反應(yīng)。離心，取上清液于722分光光度計(jì)540nm處比色，測(cè)錄光密度(OD)，另設(shè)不加血清的空白對(duì)照，取其上清液作為比色時(shí)調(diào)“0”的基準(zhǔn)以O(shè)D值作為判定血清溶血素的指標(biāo)，比較各組的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：三十烷醇高、中、低劑量組對(duì)小鼠溶血素抗體生成具有明顯促進(jìn)作用，說(shuō)明該藥可增強(qiáng)體液免疫，見表9。表9三十烷醇對(duì)小鼠溶血素的影響組別劑量(mg/kg)動(dòng)物數(shù)(只)OD值三十烷醇高劑量組150102.611±0.646**三十烷醇中劑量組75102.477±0.595**三十烷醇低劑量組37.5102.250±0.702**陽(yáng)性藥50102.398±0.789**空白模型組-101.692±0.257各組與空白模型組比較：*P＜0.05；**P＜0.01。6：三十烷醇對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響實(shí)驗(yàn)材料：同上。實(shí)驗(yàn)方法：小鼠隨機(jī)分組，每組10只。三十烷醇高、中、低各3個(gè)劑量組，陽(yáng)性藥、空白對(duì)照各一組。分組后第二天開始給藥，連續(xù)給藥1周，在最后一次給藥后一小時(shí)小鼠腹腔內(nèi)注射2％雞紅細(xì)胞(經(jīng)去除纖維蛋白，生理鹽水多次洗滌)0.2ml/只，4小時(shí)后處死小鼠，用生理鹽水沖洗腹腔，收集沖洗液、離心，傾去上清液，收集細(xì)胞涂片，涼干后用瑞氏染色液染色，油鏡下觀察。計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)，按下公式計(jì)算。(1)吞噬百分率＝吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞數(shù)，(2)吞噬指數(shù)＝被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：三十烷醇中、高劑量組具有促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用，且具有一定劑量相關(guān)性。陽(yáng)性藥也具有促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用，見表10。表10三十烷醇對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響各組與模型組比較：*P＜0.05；**P＜0.01。7：三十烷醇對(duì)環(huán)磷酰胺致Lewis小鼠白細(xì)胞數(shù)降低的升白作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠，雄性，18-20g，由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。實(shí)驗(yàn)材料：吐溫80、0.5％CMC-Na。對(duì)照品：環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞制藥有限公司，批號(hào)11030921。瘤源：Lewis肺癌腫瘤模型由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評(píng)價(jià)研究中心傳代維持。實(shí)驗(yàn)方法：聯(lián)合環(huán)磷酰胺致荷瘤小鼠骨髓抑制模型的建立取生長(zhǎng)旺盛的腫瘤，無(wú)菌條件下一勻漿法制備成細(xì)胞懸液約5～10×106/ml細(xì)胞濃度。每只小鼠右腋皮下接種0.2ml。接種第3天(150mg/kg)和第5天(100mg/kg)，除空白正常組合樣品高劑量單獨(dú)給藥組外，其余各組分別給以CTX造成聯(lián)合化療致荷瘤小鼠骨髓抑制模型。分組和給藥方法：隨機(jī)取10只小鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)作為基礎(chǔ)白細(xì)胞測(cè)試，將其余動(dòng)物以Lewis肺癌接種造成移植性腫瘤模型并隨機(jī)分組，每組10只動(dòng)物，并于接種腫瘤當(dāng)日開始給藥。三十烷醇口服給藥，CTX腹腔注射給藥。(1)環(huán)磷酰胺組(接種后第3天，150mg/kg；接種后第5天，150mg/kg)。(2)三十烷醇+環(huán)磷酰胺組150mg/kg(接種當(dāng)日開始給藥，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束)。(3)三十烷醇組150mg/kg(接種當(dāng)日開始給藥，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束)。(4)空白組(接種當(dāng)日開始給相應(yīng)溶劑，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束)。觀察指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)開始時(shí)隨機(jī)取10只小鼠進(jìn)行眼眶后靜脈叢穿刺采血，血細(xì)胞自動(dòng)分析儀(HEMAVET-950)測(cè)試血液常規(guī)。此后在環(huán)磷酰胺末次給藥后的次日開始每3天隨機(jī)取5只小鼠以上述相同方法采血測(cè)試血液常規(guī)，直至各組白細(xì)胞恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果在試驗(yàn)開始后的第6天，三十烷醇+環(huán)磷酰胺組動(dòng)物的白細(xì)胞數(shù)為正常動(dòng)物的109.09％，陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺造模組動(dòng)物的白細(xì)胞數(shù)降至正常動(dòng)物的6.21％。實(shí)驗(yàn)表明三十烷醇組動(dòng)物的白細(xì)胞數(shù)明顯高于陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺造模組動(dòng)物的白細(xì)胞數(shù)，二組之間有顯著性差異(P<0.01)。說(shuō)明在此劑量和時(shí)相點(diǎn)三十烷醇+環(huán)磷酰胺組具有明顯的拮抗環(huán)磷酰胺致Lewis肺癌小鼠白細(xì)胞數(shù)降低的作用。詳見表11，圖1。表11三十烷醇對(duì)環(huán)磷酰胺致荷瘤小鼠白細(xì)胞降低的升白作用試驗(yàn)與陰性對(duì)照比較**P<0.01，(白細(xì)胞的正常值范圍1.8-10.7K/uL)。8：三十烷醇抗角叉菜膠致炎作用研究受試藥物：低中高三個(gè)劑量組分別為50、100、200mg/kg。配制方法：將三十烷醇樣品研磨成粉末狀，稱取2g，適量吐溫-80乳化，生理鹽水溶解并定容至50ml，制得濃度為40mg/ml的高劑量受試藥，倍比稀釋獲得濃度分別為20mg/ml、10mg/ml的中劑量和低劑量受試物。給藥容量：1ml/200g大鼠。對(duì)照品：吲哚美辛腸溶片，來(lái)源：上海信誼黃河制藥有限公司，批號(hào)：120102，規(guī)格：25mg，藥物劑量：10mg/kg。配制方法：取一片對(duì)照品，研磨成粉末，用5％的碳酸氫鈉溶液溶解并定容至12.5ml，獲得濃度為2mg/ml。給藥容量：1ml/200g試劑名稱：角叉菜膠，來(lái)源：Adamas-beta，批號(hào)：P1050992，配制方法：精確稱取角叉菜膠0.15g，生理鹽水將其溶解并稀釋至15ml，即制得1％的角叉菜膠溶液。RatLTB4ELISAkit，批號(hào)：20131001A。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：品系：SD大鼠，來(lái)源：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005，體重：180-200g，性別：雄性，動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物按照體重隨機(jī)分為5組(n＝8)，分別為模型組、陽(yáng)性藥組、三十烷醇高中低三個(gè)劑量組。實(shí)驗(yàn)方法：受試藥三個(gè)劑量組每天灌胃一次，連續(xù)給藥五天，第六天給藥一小時(shí)后，大鼠麻醉，胸腔注射0.3ml1％的角叉菜膠。致炎5小時(shí)后，測(cè)量滲出液體積，取部分置入離心管中(含10M阿司匹林，4U/ml肝素)2000g離心10分鐘后獲得上清液，ELISA法測(cè)定LTB4濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由表12可以看出，與模型組相比，吲哚美辛組可以非常明顯地減少大鼠胸腔液體滲出(**P〈0.01)，三十烷醇低中高三個(gè)劑量組對(duì)大鼠胸腔液體積的減少也有非常顯著的作用(**P〈0.01，**P〈0.01，**P〈0.01)，其中中、高劑量組顯示出比陽(yáng)性藥更為明顯的效果。另外，兩次應(yīng)用ELISA法，未檢測(cè)出LTB4濃度，推測(cè)原因可能是試劑盒靈敏度不夠，或者該試劑盒所示方法不適于測(cè)動(dòng)物胸液中的LTB4水平。目前國(guó)內(nèi)未購(gòu)到如文獻(xiàn)所示的運(yùn)用同位素標(biāo)記方法檢測(cè)的試劑盒。表12三十烷醇對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠胸腔滲出液體積變化(ml)與模型組比較：**P〈0.01。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：三十烷醇三個(gè)劑量組均可以顯著減少大鼠胸腔液體滲出，具有一定的抗炎作用。ELISA法未測(cè)出LTB4水平的變化。9：三十烷醇對(duì)棉球肉芽腫的影響受試藥物：同上。對(duì)照品：同上。藥物劑量：3mg/kg。配制濃度為2mg/5ml。實(shí)驗(yàn)用品：制備棉球，每個(gè)重量為50mg，滅菌后使用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：同上。實(shí)驗(yàn)方法：大鼠麻醉后腋下植入50mg棉球(經(jīng)消毒)，按照藥物劑量，每天灌胃1次，6天后處死取出棉球，經(jīng)60℃烘干稱重，比較重量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由表13可以看出，與模型組相比，吲哚美辛組可以非常明顯地減少棉球肉芽腫重量(**P〈0.01)，三十烷醇低中高三個(gè)劑量組對(duì)棉球肉芽腫重量的減少也有非常顯著的作用(**P〈0.01，**P〈0.01，**P〈0.01)，并顯示出一定的量效相關(guān)性。表13三十烷醇對(duì)棉球肉芽腫重量的影響(g)與模型組比較：**P〈0.01。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：由表13看出，與模型組相比，三十烷醇三個(gè)劑量組均可以減少大鼠棉球肉芽腫重量，抑制增殖反應(yīng)，三十烷醇對(duì)于炎癥有一定的改善作用。附圖說(shuō)明圖1為三十烷醇對(duì)環(huán)磷酰胺致荷瘤小鼠白細(xì)胞降低的白細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：稱取50g三十烷醇和150g聚乙二醇，80g羧甲基纖維素鈉，混合，在55℃下熔融，攪拌，冷卻后碾成粉。制成硬膠囊劑，共1000粒，每粒含三十烷醇50mg。實(shí)施例2：稱取100g三十烷醇和250g聚乙二醇，120g羧甲基纖維素鈉，混合，在55℃下熔融，攪拌，冷卻后碾成粉。制成硬膠囊劑，共1000粒，每粒含三十烷醇100mg。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3