本發明屬于分子生物學及遺傳育種技術領域，更具體涉及一種與獼猴桃總酸含量性狀qtl位點緊密連鎖的分子標記及應用。
背景技術：
獼猴桃富含維生素c、膳食纖維和多種礦物質營養，是一種深受消費者青睞的健康水果。中國是獼猴桃屬植物的原始起源中心，獼猴桃資源極為豐富，遺傳多樣性高，中國擁有全世界獼猴桃物種資源總數的96％左右。憑借豐富的自然資源，選育聚合優良性狀的新品種，對獼猴桃產業的健康穩定發展起到關鍵作用。獼猴桃果實的主要酸組分為奎寧酸和檸檬酸，同時含有少量蘋果酸成分。果實中糖、酸含量及其比值對果實風味品種有著非常重要的影響。因此降低總酸含量對改善獼猴桃果實品質至關重要，是獼猴桃育種的重要目標之一。
傳統獼猴桃育種中，童期長、種植占地面積大等是影響育種效率的主要困難。隨著分子生物學和測序技術的迅猛發展，對性狀的選擇正在逐漸由表型選擇向基因型選擇過渡。分子標記輔助育種能利用與目標性狀基因緊密連鎖或共分離的分子標記對個體進行篩選，以達到提高目標性狀選擇效率、縮短育種年限的目的。近年來，在蘋果、梨、葡萄等果樹中，已成功開發了重要農藝性狀分子標記，利用分子標記進行輔助選擇也日趨成熟。然而，獼猴桃重要農藝性狀定位及相關分子標記開發工作比較匱乏。2013年，獼猴桃基因組草圖的公布為基因組學研究和獼猴桃分子輔助育種提供了重要基礎。隨后，基于構建獼猴桃高密度遺傳圖譜，開發了3個性別鑒定標記，在育種早期進行性別鑒定，避免了人力和物力的浪費。農藝性狀qtl定位就是在遺傳分離群體的基礎上，借助分子標記和遺傳圖譜，利用qtl作圖軟件對分離群體的數量性狀表型數據進行分析，從而確定數量性狀基因在染色體上的位置和效應。利用遺傳連鎖圖譜，結合表型數據開展數量性狀位點(quantitativetraitloci，qtl)掃描，已成為解析復雜數量遺傳學規律、有效定位關鍵農藝性狀、開發關聯分子標記以及對優良性狀進行早期選擇的有效手段。
目前，對獼猴桃重要品質性狀總酸的qtl定位以及發掘與總酸相關的分子標記研究尚未開展。開展獼猴桃總酸的qtl研究，基于qtl位點信息進行分子標記篩選，有助于提高對獼猴桃總酸性狀選擇的育種效率，節約育種成本，提升獼猴桃產業經濟效益。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供了一種獼猴桃第21號染色體第6144693個堿基在獼猴桃總酸含量篩選育種中的應用，包括針對獼猴桃第21號染色體第6144693個堿基設計的引物在獼猴桃總酸含量篩選育種中的應用，包括包含有獼猴桃第21號染色體第6144693個堿基的獼猴桃序列在獼猴桃總酸含量篩選育種中的應用。
本發明的目的在于提供了一種與獼猴桃總酸含量性狀qtl位點緊密連鎖的分子標記的引物，引物為ta-f：5’-gtaaatgcatggtaaagaggtcc-3’和ta-r：5’-aggagaaagggaaaataaaacgc-3’。
為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：
一種與獼猴桃總酸含量性狀qtl位點緊密連鎖的分子標記的獲得：
①使用總酸含量高的山梨獼猴桃‘mt570001’獼猴桃和總酸含量低的中華獼猴桃‘桂海4號’雜交構建f1分離群體。在該群體結果第6年，選擇125株f1群體的后代單株為研究對象。
②采集群體125份單株葉片，利用ctab法提取總dna。根據radseq方法構建中華獼猴桃‘桂海4號’、山梨獼猴桃‘mt570001’以及125株子代的文庫并測序。
③將測序數據進行過濾，去除低質量堿基含量大于50％的序列，剔除有測序接頭污染和大量重復的序列。使用軟件soap2將符合過濾標準的測序數據比對到參考基因組，對每個樣本進行位點變異檢測，統計多態性位點在群體中的遺傳類型。
④利用joinmap4.0分析軟件構建基于snp標記的獼猴桃遺傳圖譜。將符合遺傳分離規律的多態性標記位點，按joinmap4.0軟件格式導入，剔除數據缺失率在10％的位點，排除顯著偏分離位點，采用kosambi作圖函數構建高密度遺傳圖譜。
⑤在果實成熟期，對中華獼猴桃‘桂海4號’、山梨獼猴桃‘mt570001’以及125株群體單株果實的奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量進行測量。每個樣本隨機采集10個果實，使用agilent7890n氣相色譜儀通過氣相色譜法測定果實的奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量，將奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量的總和計為果實的總酸含量。
⑥將樣本總酸含量數據和標記的基因型數據導入mapqtl5.0軟件，選擇多區間作圖法，設置lod閾值為3.0，對獼猴桃總酸進行qtl定位分析。最終檢測到與總酸含量相關的主效qtl位點，對該性狀的貢獻率為21.75％，該位點與對應的snp標記在連鎖群上的遺傳距離為67.7cm。
⑦提取獼猴桃第21號染色體第6144693個堿基上下游各100bp的序列，按照設計引物原則，開發設計snp標記引物。正向引物ta-f為5’-gtaaatgcatggtaaagaggtcc-3’，反向引物ta-r為5’-aggagaaagggaaaataaaacgc-3’。擴增產物大小為150bp。
本發明的保護范圍包括：獼猴桃第21號染色體第6144693個堿基在獼猴桃總酸含量篩選育種中的應用，或者基于獼猴桃第21號染色體第6144693個堿基設計的引物在獼猴桃總酸含量篩選育種中的應用，或是seqidno.3所示序列在獼猴桃總酸含量篩選育種中的應用。
以上所述的應用，可利用現有技術，對待檢獼猴桃的第21號染色體的第6144693個堿基進行檢測，實現對獼猴桃總酸含量進行早期篩選的育種目的。
本發明的積極效果：
本發明首次定位了獼猴桃中控制總酸的主效qtl位點，可解釋21.75％的表型方差。在常規育種方法中，獼猴桃總酸含量的測定要等到成熟期，浪費大量時間和精力，且選擇效率低下，而通過檢測與總酸含量主效位點連鎖的分子標記，可以在早期進行淘汰，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率。本發明中獼猴桃總酸的主效基因位點位置明確，分子標記位點的檢測方法方便快捷，不受環境影響。通過檢測與總酸性狀相關的分子標記，即可預測獼猴桃總酸含量，進而準確快速篩選總酸含量低的優良單株。
具體實施方式
本發明所述技術方案，如未特別說明，為常規技術；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業渠道。
實施例1：
與獼猴桃總酸主效qtl及開發連鎖的分子標記的獲得：
①本實施例中使用總酸含量高的山梨獼猴桃‘mt570001’獼猴桃和總酸含量低的中華獼猴桃‘桂海4號’雜交構建f1分離群體。在該群體結果第6年，選擇125株f1群體的后代單株為研究對象。
②采集群體125份單株葉片，利用ctab法提取總dna。根據radseq方法構建中華獼猴桃‘桂海4號’、山梨獼猴桃‘mt570001’以及125株子代的文庫并測序。
③將測序數據進行過濾，去除低質量堿基含量大于50％的序列，剔除有測序接頭污染和大量重復的序列。使用軟件soap2將符合過濾標準的測序數據比對到參考基因組，對每個樣本進行位點變異檢測，統計多態性位點在群體中的遺傳類型。
④利用joinmap4.0分析軟件構建基于snp標記的獼猴桃遺傳圖譜。將符合遺傳分離規律的多態性標記位點，按joinmap4.0軟件格式導入，剔除數據缺失率在10％的位點，排除顯著偏分離位點，采用kosambi作圖函數構建高密度遺傳圖譜。
⑤在果實成熟期，對中華獼猴桃‘桂海4號’、山梨獼猴桃‘mt570001’以及125株群體單株果實的奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量進行測量。每個樣本隨機采集10個果實，使用agilent7890n氣相色譜儀通過氣相色譜法測定果實的奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量，將奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量的總和計為果實的總酸含量。
⑥將樣本總酸含量數據和標記的基因型數據導入mapqtl5.0軟件，選擇多區間作圖法，設置lod閾值為3.0，對獼猴桃總酸含量進行qtl定位分析。最終檢測到與總酸相關的主效qtl位點，對該性狀的貢獻率為21.75％，該位點與對應的snp標記在連鎖群上的遺傳距離為67.7cm。
⑦提取獼猴桃第21號染色體第6144693個堿基上下游各100bp的序列，按照設計引物原則，開發設計snp標記引物。正向引物ta-f為5’-gtaaatgcatggtaaagaggtcc-3’，反向引物ta-r為5’-aggagaaagggaaaataaaacgc-3’。擴增產物大小為150bp。
在中華獼猴桃‘桂海4號’中擴增的序列為seqidno.3所示；
在山梨獼猴桃‘mt570001’中擴增的序列為seqidno.4所示。
⑧利用高分辨率溶解曲線(hrm)技術對總酸含量進行分型。按照
⑨對該分子標記的擴增產物溶解曲線進行分析，125個雜交后代分為兩類基因型。線型分組1(與親本中華獼猴桃‘桂海4號’的溶解曲線相同)中，57個后代單株的平均總酸含量為19.6mg/g；線型分組2(與親本山梨獼猴桃‘mt570001’的溶解曲線相同)中，68個后代單株平均總酸含量為24.5mg/g。對125個雜交子代的總酸含量進行顯著性檢測，分析顯示兩類基因型個體的總酸含量差值為4.9mg/g，差異極其顯著(p<0.005)。因此，通過對總酸的測定和hrm分析結果分析，證明該特異分子標記可以檢測獼猴桃總酸含量的差異。
實施例2：
一種與獼猴桃總酸性狀qtl位點緊密連鎖的分子標記在獼猴桃育種中的應用，其步驟是：
(1)以國家獼猴桃資源圃中具有抗寒性高、抗病性好但總酸含量高的山梨獼猴桃做為母本，果實風味佳且總酸含量低的中華獼猴桃為父本雜交得到f1代。選取f1代群體中60個單株為研究對象。
(2)在果實成熟期，選取f1代群體60個單株，每株采集10個果實，使用agilent7890n氣相色譜儀通過氣相色譜法測定果實的奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量，將奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸含量的總和計為果實的總酸含量。
(3)提取f1代60個單株的總dna，按照
對該分子標記的擴增產物溶解曲線進行分析，60個雜交后代分為兩類基因型。線型分組1(與親本中華獼猴桃‘桂海4號’的溶解曲線相同)中，33個后代單株的平均總酸含量為18.6mg/g；線型分組2(與親本山梨獼猴桃‘mt570001’的溶解曲線相同)中，27個后代單株平均總酸含量為23.8mg/g。對60個雜交子代的平均總酸含量進行顯著性檢測，分析顯示兩類基因型個體的平均總酸含量差值為5.2mg/g，差異極其顯著(p<0.005)。因此，通過對總酸的測定和hrm分析結果分析，說明通過分子標記輔助選擇總酸位點，可以明顯提高選擇效率。
sequencelisting
<110>中國科學院武漢植物園
<120>一種與獼猴桃總酸含量性狀qtl位點緊密連鎖的分子標記及應用
<130>一種與獼猴桃總酸含量性狀qtl位點緊密連鎖的分子標記及應用
<160>4
<170>patentinversion3.1
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
gtaaatgcatggtaaagaggtcc23
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
aggagaaagggaaaataaaacgc23
<210>3
<211>150
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gtaaatgcatggtaaagaggtccactatcaaacaagtgcaggcattttggagccgtaagt60
ttctatgatgatattttttgcccttctcaagaatcggatggttaatatgctttcagtttc120
tccagttgcgttttattttccctttctcct150
<210>4
<211>150
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gtaaatgcatggtaaagaggtccactatcaaacaagtgcaggcattttggagccgtaagt60
ttctacgatgatattttttgcccttctcaagaatcggatggttaatatgctttcagtttc120
tccagttgcgttttattttccctttctcct150