本發(fā)明涉及一種基于talens基因編輯花生育種方法，屬于農業(yè)生物工程
技術領域：
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背景技術：
：花生又名落花生，屬一年生草本植物，是我國重要的油料和經濟作物。我國的花生種植面積和生產總量均居世界前列在國際上具有很強的競爭力。油酸是花生油脂中的主要脂肪酸，因為油酸具有較好的氧化穩(wěn)定性，從而減少脂質氧化，從而解決花生制品在生產和儲存期間由于脂質氧化而產生的不良的氣味、口味及貨架期縮短等問題。油酸還是一種單不飽和脂肪酸能降低身體低密度脂蛋白(ldl)水平，維持高密度脂蛋白(hdl)水平。所以高油酸花生不僅可以有效延長花生制品的保質期和貨架期，同時也有益于人們的身體健康。選育高油酸花生新品種是花生育種的重要目標之一。目前已知fad2(δ12脂肪酸脫氫酶)是脂肪酸生物合成途徑中催化油酸在第12碳位脫氫，形成雙鍵向亞油酸基轉變的關鍵酶。傳統(tǒng)育種思路是通過自然突變體(如美國篩選出來的f435)或者通過誘變篩選出來的高油酸突變體進行雜變，回交改良，這些育種方法都存大育種效率低，時間較長等缺點。花生是異源四倍體植物，高油酸花生中fad2a基因起始密碼子后448bp處g:c→a：t的替換使得d150n氨基酸的變異，fad2b基因起始密碼子后442bp處a插入，使得終止密碼子提前出現(xiàn)，從而使得fad2基因的表達降低或功能喪失。傳統(tǒng)的雜交育種方法需要很難做到精準突變，并且費時費力。技術實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種提高花生油酸的基于talens基因編輯花生育種方法。實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術方案達到：一種基于talens基因編輯花生育種方法，包括以下步驟：1)talens左右臂序列的設計：分析花生品種的fad2基因的序列，并設計左右臂序列；2)組裝至表達載體：將步驟1)得到的左右臂序列組裝至植物表達載體并轉染農桿菌，得到含有轉化質粒的農桿菌；3)遺傳轉化：將步驟2)得到的含有轉化質粒的農桿菌遺傳轉化至花生種子；4)選育：根據目標性狀選育。作為優(yōu)選，步驟1)中，所述左右臂序列中左臂序列為seqidno.1，右臂序列為seqidno.2。作為優(yōu)選，步驟1)中，所述左右臂序列中左臂序列為seqidno.3，右臂序列為seqidno.4。作為優(yōu)選，步驟2)中，所述表達載體為pcambia3301或pcambia1301。作為優(yōu)選，步驟3)中，遺傳轉化的具體操作為：a)用花生種子制作外植體；b)將含有轉化質粒的農桿菌接種至yep培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集菌體，將菌體重懸于含有乙酰丁香酮的液體ms培養(yǎng)基中，得到侵染液；c)將外植體浸浮于侵染液，共培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)后外植體。作為優(yōu)選，步驟c)中，共培養(yǎng)前，向侵染液加入0.1wt％的silweetl-77。作為優(yōu)選，步驟4)中，所述目標性狀為油酸含量大于60％。本發(fā)明的配方設計原理如下：本發(fā)明將已經發(fā)布花生的fad2基因序列在ncbi數(shù)據庫和花生野生種基因庫進行比較，為了使得fad2基因失去功能，同時避開fad2a和fad2b的snp位點，在fad2基因序列的起始密碼子附近，共設計以下幾條左右兩臂的識別序列，通過兩兩組合的方式找到最佳的基因編輯。其中，其中l(wèi)1r1的間隔距離為13bp,l1r2的間隔距離為14bp，l2r1的間隔距離為16bp,l2r2的間隔距離為17bp,l3r1的間隔距離為14bp,l3r2的間隔距離為15bp。本發(fā)明將已經發(fā)布花生的fad2基因序列在ncbi數(shù)據庫和花生野生種基因庫進行比較，為了使得fad2基因失去功能，同時避開fad2a和fad2b的snp位點，在fad2基因序列的起始密碼子附近，共設計以下幾條左右兩臂的識別序列，通過兩兩組合的方式找到最佳的基因編輯。相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種能有效提高花生油酸含量的基因編輯方法，該高油酸含量的性狀可穩(wěn)定地遺傳至子代。附圖說明圖1為l1r1為載體編輯粵油7號的t0代種子油酸含量。圖2為l2r2為載體編輯粵油7號的t0代種子油酸含量。具體實施方式下面，結合附圖以及具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述：實施例1：talens左右臂基因的設計本發(fā)明將已經發(fā)布花生的fad2基因序列在ncbi數(shù)據庫和花生野生種基因庫進行比較，為了使得fad2基因失去功能，同時避開fad2a和fad2b的snp位點，在fad2基因序列的起始密碼子附近，共設計以下三條左臂基因和兩條右臂的識別序列，如seqidno.1所示的l1、如seqidno.3所示的l2、如seqidno.5所示的l3，如seqidno.2所示的r1和如seqidno.4所示的r2。l1：caaaagaagcctctttl2：gaagctcaaaagaagcctcl3：caaaagaagcctcttr1：ttcaaaccctccattcr2：tcaaaccctccattc再通過兩兩組合的方式找到最佳的基因編輯。其l1和r1組合成l1r1的間隔距離為13bp，l1和r2組合成l1r2的間隔距離為14bp，l2和r1組合成l2r1的間隔距離為16bp，l2和r2組合成l2r2的間隔距離為17bp，l3和r1的組合的成l3r1的間隔距離為14bp，l3和r2組合成l3r2的間隔距離為15bp。實施例2：克隆至表達載體通過斯丹賽公司的talenkit試劑盒，將實施例1得到的talens左右臂序列l(wèi)1r1、l1r2、l2r1、l3r1和l3r2分別進行組裝，再分別亞克隆至植物表達載體，并轉染農桿菌，挑選陽性菌種，得到含有轉化質粒的農桿菌。實施例3：遺傳轉化a)用花生種子制作外植體：取粵油7號花生種子，對花生種子進行編號，設置對照組編號為wt，將花生種子去殼，用蒸餾水沖洗，再在蒸餾水中浸泡30-60分鐘；然后消毒，去種皮，沿子葉間縫隙切開種子，取含胚的半粒種子，再沿胚的子葉節(jié)點切去胚芽，得到待轉化的外植體；b)將實施例2)得到的含有待轉化質粒的農桿菌接種至yep液體培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；將yep液體培養(yǎng)液離心收集農桿菌菌體，并將農桿菌菌體重懸于含有乙酰丁香酮的液體ms培養(yǎng)基中，得到侵染液；c)將步驟a)得到的待轉化的外植體浸浮于步驟b)得到的侵染液中，加入0.1wt％的silweetl-77，侵染10-20分鐘，然后將外植體和侵染液在真空條件下靜置10-20分鐘；取出外植體，濾干菌液后平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)2-3天；再在光照16h/d的條件下培養(yǎng)7-10天，得到共培養(yǎng)后的外植體；共培養(yǎng)后的外植體的識別區(qū)的序列的變化情況下表所示，表1l1r1編輯種子識別區(qū)的序列變化情況表2l2r2編輯種子識別區(qū)的序列變化情況d)將共培養(yǎng)后的外植體移至滅菌砂土中，培養(yǎng)馴化后，移入溫室中繁殖。實施例4：油酸檢測收獲實施例3外植體的t0代種子，檢測實施例3得到的外植體種子的油酸含量，大于60％的視為陽性株。各talens左右臂的轉化株數(shù)、陽性株數(shù)和頻率統(tǒng)計如下表所示：表3選育結果統(tǒng)計利用非破損型紅外檢測儀對t0代種子進行油酸含量檢測，結果圖1和2所示，通過l1r1和l2r2進行編輯fad2基因均可得到高油酸的花生，其中，l2r2的轉化率較l1r1要高，這可能與左右臂的間隔距離有關，在花生中，左右臂間隔距離在14-16bp的距離是不利于剪切酶形成二聚體結構，從而無法編輯花生的fad2基因，而間隔距離為17bp的l2r2的效果比間隔距離為13bp的l1r1要好，其中，314號油酸含量高達90％。實施例5：選育將實施例4檢測到的油酸含量高于60％的t0代種子進行種植，得到t1代種子，利用非破損型的近紅外檢測儀進行油酸含量的檢測分析結果如下：表4t1代種子油酸含量由上表的結果可知，t1代種子的油酸含量與t0代相比，并未降低，甚至還要高于t0代種子，說明，經過本發(fā)明提供的方法進行的育種，其高油酸含量的性狀可穩(wěn)定地遺傳。實施例6：驗證將實施例2得到的含有l(wèi)1r1左右臂序列的轉化質粒的農桿菌以及含有l(wèi)2r2左右臂序列的轉化質粒。對粵油13號花生種子進行基因編輯操作，其t0代種子油酸含量下表所示：表5粵油13號t0代種子油酸含量樣品號左右臂序列對油酸[％]wt無30.941l1r162.785l1r163.318l1r172.9112l1r161.0811l1r169.1913l1r167.2821l2r271.9899l2r262.31將t0代種子進行遺傳育種，得到t1代種子，其油酸含量如下表所示：表6粵油13t1代種子油酸含量樣品號油酸[％]樣品號油酸[％]樣品號油酸[％]樣品號油酸[％]1－163.218－172.2111－270.3213－366.831－262.328－272.3311－369.3221－169.781－363.248－372.3511－468.8921－268.981－462.8712－160.9211－571.2399－164.225－163.1112－261.3211－669.2299－263.785－263.4212－362.2113－166.2399－363.235－363.2311－170.1213－267.3499－462.43將t1代種子編號8的株系進行進一步的跟蹤檢測，其t2代種子進行近紅外光譜儀的檢測結果如下表所示：表7粵油13t2代種子油酸含量樣品號油酸[％]樣品號油酸[％]樣品號油酸[％]樣品號油酸[％]8－1－172.238－1－771.768－2－670.828－3－371.208－1－271.988－1－871.898－2－771.108－3－471.108－1－372.328－2－172.138－2－873.198－3－570.988－1－472.428－2－372.338－2－972.318－3－671.348－1－573.118－2－472.118－3－172.248－3－769.688－1－672.458－2－572.148－3－272.438－3－870.88由以上驗證試驗可知，l1r1或l2r2作為talens左右臂序列，其能使花生種子的油酸含量大幅增高，且該高油酸性狀具有較好的遺傳穩(wěn)定性。對于本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。sequencelisting<110>廣東省農業(yè)科學院作物研究所<120>一種基于talens基因編輯花生育種方法<130>一種基于talens基因編輯花生育種方法<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列<400>1caaaagaagcctcttt16<210>2<211>16<212>dna<213>人工序列<400>2ttcaaaccctccattc16<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3gaagctcaaaagaagcctc19<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列<400>4tcaaaccctccattc15<210>5<211>15<212>dna<213>人工序列<400>5caaaagaagcctctt15當前第1頁12