本發明涉及一種腹主動脈瘤疾病動物模型的制備方法，特別涉及通過利用表達突變的pcsk9的腺相關病毒感染動物來建立腹主動脈瘤疾病動物模型的方法，屬于心血管實驗動物模型技術領域。

背景技術：

腹主動脈瘤是指腹主動脈局部梭形或囊性膨脹，管腔內徑超過正常值50％的一種病理狀態，它是具有潛在致死危險的疾病，一旦瘤體破裂，死亡率超過80％。在美國，腹主動脈瘤的年發病率約為20-40/10萬人，占疾病死因的第13位，在我國腹主動脈瘤的發病率也呈逐年上升的趨勢，65歲以上男性超聲檢出腹主動脈瘤的發病率高達5％。由于腹主動脈瘤的發病機制不明，臨床上一直未找到防治腹主動脈瘤的有效藥物。因此，進一步闡明腹主動脈瘤的發生機制并尋找有效的干預措施是當前心血管病領域中一個亟需解決的重大課題。

由于心血管疾病受到多種遺傳因素即基因的影響，所以推動了基因工程小鼠在此方向上的研究。小鼠的基因組和人類具有90％以上的同源性。大多數人類疾病的研究，特別是遺傳疾病的研究，不可能直接以人類為實驗材料，而通過小鼠來承載這樣的實驗就成為一種最佳選擇。基因工程小鼠是生命科學研究的重要支撐條件，具有以下特點：基因同源性高、可控性強、使用經濟、操作簡單等，廣泛用于探索生命奧秘、研究疾病機制及防治等領域，特別是在心血管領域的研究。傳統的制備腹主動脈瘤動物模型的方法是利用apoe敲除鼠(apoe^-/-)皮下埋angii泵至少四周，時間長，而且apoe敲除鼠的市場價格為350元/只,價格高。這嚴重制約了相關研究工作的廣泛開展。

技術實現要素：

本發明針對現有技術的不足，提供一種腹主動脈瘤疾病動物模型的制備方法。

本發明技術方案如下：

一種腹主動脈瘤疾病動物模型的制備方法，步驟如下：

第一步，paav/d377y-mpcsk9載體的構建：

1)將paav-mcs質粒經內切酶ecori和內切酶hindiii雙酶切，制得paav-mcs酶切產物；

2)將paav-mcs酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收4700bp的dna片段，純化，得到純化后的paav-mcs酶切產物；

3)以小鼠肝臟cdna為模板，經pcr擴增，純化，制得mpcsk9dna片段；

pcr擴增的特異引物核苷酸序列如下：

正向引物：5’gaattcatgggcacccactgctctgcgtgg3’；

反向引物：5’aagctttcactgaacccaggaggcctttgc3’；

4)將步驟3)制得的mpcsk9dna片段經內切酶ecori和內切酶hindiii雙酶切，制得mpcsk9酶切產物；

5)將mpcsk9酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含2000bp大小的dna片段，純化，得到純化后的mpcsk9酶切產物；

6)將步驟2)純化后的paav-mcs酶切產物和步驟5)純化后的mpcsk9酶切產物進行連接，制得連接產物；

7)將步驟6)制得的連接產物轉化大腸桿菌，經抗性篩選和測序驗證后，制得提取質粒paav/mpcsk9，然后將mpcsk9的377位點天冬氨酸突變為酪氨酸，經dpn1內切酶酶切，抗性篩選和測序驗證后，制得提取質粒paav/d377y-mpcsk9；

第二步，制備表達d377y-mpcsk9的腺相關病毒：

將提取質粒paav/d377y-mpcsk9和輔助質粒paav-rc8、輔助質粒phelper，在ultra-pei試劑條件下，共轉入aav293細胞，提取質粒paav/d377y-mpcsk9：輔助質粒paav-rc8：輔助質粒phelper的質量比為2:1:1，轉染后收集病毒，經超離心純化，同時測定病毒滴度，制得表達d377y-mpcsk9的腺相關病毒；

第三步，病毒感染獲得腹主動脈瘤疾病動物模型：

將8周齡的c57bl/6小鼠經尾靜脈注射1.0×10¹¹拷貝數的表達d377y-mpcsk9的腺相關病毒，同時背部皮下植入1.44mg/kg/day的微滲透壓泵，同時給予高脂飲食三周，即得。

根據本發明優選的，所述第一步1)中的雙酶切反應體系如下：

加滅菌超純水至體積30μl；

雙酶切反應條件：37℃水浴2小時。

根據本發明優選的，所述第一步2)、3)、5)中的純化采用axyprepdna凝膠回收試劑盒。

根據本發明優選的，所述第一步3)中，pcr反應體系如下：

加滅菌超純水至體積50μl；

反應條件：98℃變性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸2min，34cycles。

制得的mpcsk9dna片段長度為2000bp。

根據本發明優選的，所述第一步3)中，小鼠肝臟cdna采用如下方法制備：

a、取新鮮小鼠肝組織置于ep管中，加入200μltrizol充分研磨后，補加800μltrizol，混勻；

b、加入200μl氯仿，劇烈震蕩15秒，4℃12000rpm離心15min；

c、將上層水相移至潔凈ep管中，加入500μl異丙醇顛倒混勻；

d、4℃、12000rpm離心10min；

e、棄水相，ep管開蓋干燥，溶于50μldepc水中；

f、進行反轉錄反應，制得小鼠肝臟cdna；反轉錄反應體系如下，總體積10μl：

反轉錄反應條件：37℃15min，85℃5sec。

根據本發明優選的，所述第一步4)中，雙酶切反應體系如下：

加滅菌超純水至體積30μl；

雙酶切反應條件：37℃水浴2小時。

根據本發明優選的，所述第一步6)中，連接采用t4dna連接酶和快速連接試劑盒。

根據本發明優選的，所述第一步7)中，mpcsk9的377位點天冬氨酸突變為酪氨酸的反應特異引物核苷酸序列如下：

正向引物：5'-gaagcatgtgctgcaataactggacgctccgatgatgtc-3'；

反向引物:5'-gacatcatcggagcgtccagttattgcagcacatgcttc-3'；

反應體系如下，體系總體積50μl：

反應條件：95℃30sec，55℃1min，68℃7min，16個循環。

根據本發明優選的，所述第一步7)中，dpn1內切酶酶切條件為：1μldpn1內切酶，37℃水浴1小時。

根據本發明優選的，所述第一步制得的paav/d377y-mpcsk9載體的核苷酸序列如seqidno.1所示。

根據本發明優選的，所述第二步中制備d377y-mpcsk9的腺相關病毒的具體步驟如下：

①接種aav293細胞至含有dmem培養基的10cm培養皿中，培養至匯合度為70～90％；

②使用250μl無血清培養基稀釋48μlultra-pei試劑；

③使用250μl無血清培養基稀釋8μgpaav/d377y-mpcsk9質粒、4μgpaav-rc8質粒和4μgphelper質粒，得到質粒預混液；

④在已稀釋的ultra-pei試劑中加入③制得的質粒預混液，室溫孵育14～16min，得到dna-脂質體復合物；

⑤將dna-脂質體復合物加入①制得的細胞培養液中；

⑥轉染后培養24、48、72h，分別收集富含腺相關病毒顆粒的上清液，上清液通過超離心濃縮病毒，制得表達d377y-mpcsk9的腺相關病毒。

根據本發明優選的，所述第三步中，背部皮下植入采用angii微滲透壓泵。

根據本發明優選的，所述第三步中，高脂飲食中含有不低于如下百分含量的營養成分：脂肪16％、膽固醇1.25％、膽酸鹽0.5％。

有益效果

本發明利用前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(pcsk9)為分泌型絲氨酸蛋白酶，可與低密度脂蛋白膽固醇受體(ldlr)結合并將其內化引導至溶酶體降解，抑制其再循環到肝細胞表面，從而減弱肝臟代謝血漿的低密度脂蛋白膽固醇(ldl)能力，通過pcsk9基因的增義突變(mpcsk9的377位點天冬氨酸(d)突變為酪氨酸(y))可以減少肝細胞表面可循環使用的ldlr數量，上調ldl水平導致高膽固醇血癥，最終導致嚴重的心血管疾病，成功建立了腹主動脈瘤動物模型，極大降低了動物模型的制備成本，縮短了制備時間。

附圖說明

圖1為解剖拍照檢測不同組的腹主動脈瘤的成瘤結果照片；

圖2為統計不同組的成瘤率和最大腹主動脈直徑的柱狀圖。

具體實施方式

下面結合實施例及說明書附圖對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。

以下實施例中所使用的paav-mcs質粒購自cellbiolabs公司，酶切反應采用thermo限制性內切酶。

axyprepdna凝膠回收試劑盒購自axygen公司。

pcr反應采用takara公司的primerstarhsdnapolymerase。

axypreppcr清潔試劑盒購自axygen公司。

t4dna連接酶和快速連接試劑盒購自neb公司。

突變試劑盒iisite-directedmutagenesiskit購自stratagene公司。

感受態大腸桿菌細胞購自tiangen公司。

質粒小量dna提取試劑盒購自axygen公司。

paav-rc8質粒和phelper質粒購自addgene公司。

ultra-pei轉染試劑盒購自好芝生物公司。

aav293細胞購自上海極威生物科技有限公司。

dmem培養基購自invitrogen公司。

實施例1

一種腹主動脈瘤疾病動物模型的制備方法，步驟如下：

第一步，paav/d377y-mpcsk9載體的構建：

1)將paav-mcs質粒經內切酶ecori和內切酶hindiii雙酶切，制得paav-mcs酶切產物；

所述雙酶切反應體系如下：

加滅菌超純水至體積30μl；

雙酶切反應條件：37℃水浴2小時。

2)將paav-mcs酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收4700bp的dna片段，采用axyprepdna凝膠回收試劑盒純化，得到純化后的paav-mcs酶切產物；

3)以小鼠肝臟cdna為模板，經pcr擴增，采用axyprepdna凝膠回收試劑盒純化，制得mpcsk9dna片段；

pcr擴增的特異引物核苷酸序列如下：

正向引物：5’gaattcatgggcacccactgctctgcgtgg3’；

反向引物：5’aagctttcactgaacccaggaggcctttgc3’；

pcr反應體系如下：

加滅菌超純水至體積50μl；

反應條件：98℃變性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸2min，34cycles。

制得的mpcsk9dna片段長度為2000bp。

所述小鼠肝臟cdna采用如下方法制備：

a、取新鮮小鼠肝組織置于ep管中，加入200μltrizol充分研磨后，補加800μltrizol，混勻；

b、加入200μl氯仿，劇烈震蕩15秒，4℃12000rpm離心15min；

c、將上層水相移至潔凈ep管中，加入500μl異丙醇顛倒混勻；

d、4℃、12000rpm離心10min；

e、棄水相，ep管開蓋干燥，溶于50μldepc水中；

f、進行反轉錄反應，制得小鼠肝臟cdna；反轉錄反應體系如下，總體積10μl：

反轉錄反應條件：37℃15min，85℃5sec。

4)將步驟3)制得的mpcsk9dna片段經內切酶ecori和內切酶hindiii雙酶切，制得mpcsk9酶切產物；

所述雙酶切反應體系如下：

加滅菌超純水至體積30μl；

雙酶切反應條件：37℃水浴2小時。

5)將mpcsk9酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含2000bp大小的dna片段，采用axyprepdna凝膠回收試劑盒純化，得到純化后的mpcsk9酶切產物；

6)將步驟2)純化后的paav-mcs酶切產物和步驟5)純化后的mpcsk9酶切產物進行連接，連接采用t4dna連接酶和快速連接試劑盒，制得連接產物；

7)將步驟6)制得的連接產物轉化大腸桿菌，經抗性篩選和測序驗證后，制得提取質粒paav/mpcsk9，然后利用stratagene的iisite-directedmutagenesiskit將mpcsk9的377位點天冬氨酸突變為酪氨酸，經dpn1內切酶酶切，抗性篩選和測序驗證后，制得提取質粒paav/d377y-mpcsk9；

所述mpcsk9的377位點天冬氨酸突變為酪氨酸的反應特異引物核苷酸序列如下：

正向引物：5'-gaagcatgtgctgcaataactggacgctccgatgatgtc-3'；

反向引物:5'-gacatcatcggagcgtccagttattgcagcacatgcttc-3'；

反應體系如下，體系總體積50μl：

反應條件：95℃30sec，55℃1min，68℃7min，16個循環。

所述dpn1內切酶酶切條件為：1μldpn1內切酶，37℃水浴1小時。

第二步，制備表達d377y-mpcsk9的腺相關病毒：

將提取質粒paav/d377y-mpcsk9和輔助質粒paav-rc8、輔助質粒phelper，在ultra-pei試劑條件下，共轉入aav293細胞，提取質粒paav/d377y-mpcsk9：輔助質粒paav-rc8：輔助質粒phelper的質量比為2:1:1，轉染后收集病毒，經超離心純化，同時測定病毒滴度，制得表達d377y-mpcsk9的腺相關病毒；具體步驟如下：

①接種aav293細胞至含有dmem培養基的10cm培養皿中，培養至匯合度為70～90％；

②使用250μl無血清培養基稀釋48μlultra-pei試劑；

③使用250μl無血清培養基稀釋8μgpaav/d377y-mpcsk9質粒、4μgpaav-rc8質粒和4μgphelper質粒，得到質粒預混液；

④在已稀釋的ultra-pei試劑中加入③制得的質粒預混液，室溫孵育14～16min，得到dna-脂質體復合物；

⑤將dna-脂質體復合物加入①制得的細胞培養液中；

⑥轉染后培養24、48、72h，分別收集富含腺相關病毒顆粒的上清液，上清液通過超離心濃縮病毒，制得表達d377y-mpcsk9的腺相關病毒。

⑦第三步，病毒感染獲得腹主動脈瘤疾病動物模型：

將8周齡的c57bl/6小鼠經尾靜脈注射1.0×10¹¹拷貝數的表達d377y-mpcsk9的腺相關病毒，同時背部皮下植入1.44mg/kg/day的angii微滲透壓泵，同時給予高脂飲食三周，即得；

高脂飲食中含有不低于如下百分含量的營養成分：

脂肪16％、膽固醇1.25％、膽酸鹽0.5％。

對比例1

直接在c57bl/6小鼠的背部皮下植入angii微滲透壓泵(1.44mg/kg/day)三周，沒有經尾靜脈注射d377y-mpcsk9腺相關病毒。

對比例2

采用傳統的制備腹主動脈瘤的方法，即在apoe-^/-小鼠的背部皮下植入angii微滲透壓泵(1.44mg/kg/day)四周。

實驗例

將實施例1中的經尾靜脈注射d377y-mpcsk9腺相關病毒的c57bl/6小鼠命名為pcsk9組，對比例1中進行實驗的沒有經尾靜脈注射d377y-mpcsk9腺相關病毒的c57bl/6小鼠命名為c57組，對比例2中進行實驗的apoe-^/-小鼠命名為apoe-^/-組。c57組、apoe-^/-組和pcsk9組進行實驗的小鼠各為30只。

采用解剖方法檢測各組小鼠腹主動脈瘤的成瘤情況，得到的結果如圖1和圖2所示。c57組小鼠沒有形成腹主動脈瘤，apoe-^/-組小鼠的成瘤率約60％，而pcsk9組小鼠的成瘤率約90％。此外，pcsk9組小鼠形成的腹主動脈瘤直徑大于apoe-^/-組小鼠(*p<0.05，表示有統計學差異)。

上述結果表明：經尾靜脈注射d377y-mpcsk9腺相關病毒的c57bl/6小鼠在angii作用下可以形成明顯的腹主動脈瘤，效果要比傳統的利用apoe-^/-小鼠制備的腹主動脈瘤更好。

sequencelisting

<110>山東大學

<120>一種腹主動脈瘤疾病動物模型的制備方法

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>6703

<212>dna

<213>人工合成

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<221>misc_feature

<222>(4189)..(4196)

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