本發明涉及檢測人體基因組中具有多態性的遺傳標記，尤其涉及的是人類y-str29個基因座熒光標記復合擴增試劑盒。
背景技術：
：人類dna短串重復序列(shorttandemrepeat，str)基因座是一類由2-6個核苷酸為重復單元組成的幾十至一百多個的核苷酸重復序列，在人類基因組中分布廣泛，多態性好，采用聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，pcr)擴增，電泳分型，適合于各種樣品檢測，因此被廣泛地應用于遺傳學、i臨床醫學、生物學以及法科學等領域中，被譽為新一代最重要的dna指紋。同一str基因座的基因型分布有群體差異，str基因座的等位基因片段大小差異小，擴增條件相似，可同時進行多個基因座的同步擴增，既可節約時間、試劑和檢材，又可提高工作效率和個人識別機率。目前市場上主流的商品化試劑盒通常采用的是五色熒光檢測技術,有yfiler、yfilerplus、powerplexy23、goldeneyey26、strtyper27y、agcudatabasey24等熒光檢測試劑盒，基因座數量分別為17個、27個、23個、26個、27個、24個，會存在包含的基因座少，識別率低，不適合也不能滿足科研和辦案實際的需要的問題；此外，由于地域、種族、民族之間遺傳學特點不同，采用有些y-str商業化試劑盒對中國群體進行分型檢驗的個體識別率較低。因此，需要開發出更適用于我國群體特征的穩定性好、個體別率更高、檢測基因座數更多的y-str試劑盒。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術中的遺傳學特點不同、個體識別率較低、具有等位基因越界的風險的缺陷，提供一種針對中國人群的多態性高、性能穩定、操作簡單和能同時檢測更多基因座的檢測體系：人類29個y-str基因座的熒光復合擴增試劑盒來解決上述問題。本發明是通過以下技術方案實現的：人類y-str29個基因座熒光標記復合擴增試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒包含29對str基因座的特異性擴增引物，其中str基因座為:dys391、dys456、dys19、dys448、dys385a/b、dys392、dys389i、dys449、dys389ii、dys438、dys570、dys390、dys437、dys460、dys533、dys481、dys576、dys549、dys518、dyf387s1a/b、dys557、dys393、gatah4、dys439、dys447、dys458、dys635，針對上述29個y-str基因座，在其重復序列的側翼分別設計特異性熒光標記引物。優選地，復合擴增體系個基因座引物序列如下表：優選地，所述的29對str基因座的特異性擴増引物分為五組:第一組，dys391、dys456、dys19、dys448、dys385a、dys385b；第二組，dys392、dys389i、dys449、dys389ii、dys438、dys570；第三組，dys390、dys437、dys460、dys533、dys481、dys576；第四組，dys549、dys518、dyf387s1a、dyf387s1b、dys557；第五組，dys393、gatah4、dys439、dys447、dys458、dys635。作為優選，將所述的五組引物依次分別用紅色pet、黃色ned、藍色fam、綠色vic、和紫色熒光素vig標記其5'端。優選地，所述的試劑盒內設有內標，內標由一組大小固定且不同的dna片段組成，內標用siz橙色熒光標記物。優選地，所述的試劑盒包括反應混合液、29對str基因座的特異性擴増引物、29個基因座的等位基因、熱啟動taq酶、dna標準品、sdh20和熒光分子量內標。作為優選，所述的復合擴增試劑盒具體成分為：優選地，所述擴增反應體系具體成分為：組分反應體積反應混合液10uly29熒光引物6ul熱啟動taq酶1ul人類dna樣本0.2-0.3ngsdh2o補足至25.0ul作為優選，所述的擴增反應的條件如下：反應擴增程序為：94℃2min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共29個循環；72℃10min。本發明提供的人類y-str29個基因座熒光標記復合擴增試劑盒，所述的試劑盒包含29對str基因座的特異性擴增引物，所述的29對str基因座的特異性擴増引物分為五組，分別采用不同的熒光色標記，即五組引物依次分別用紅色pet、黃色ned、藍色fam、綠色vic、和紫色熒光素vig標記其5'端，擴增上述基因座的引物，本發明通過上述基因座的特異性引物的設計以及獨特的基因座組合熒光標記方式，使得本發明復合擴增體系中，僅采用五種標記就可以在同一個復合擴增體系中同時擴增本發明的29個基因座，靈敏度非常高。與現有技術相比，本發明的熒光標記復合擴增試劑盒更針對中國人群，多態性高、性能穩定、操作簡單和能同時檢測更多基因座的檢測體系。此外，本試劑盒具有較好的溫度耐受性，使用不同質量的pcr儀均可獲得較好的擴增結果。具體實施方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1本試劑盒包括：反應混合液、29對str基因座的特異性擴増引物、29個基因座的等位基因、熱啟動taq酶、dna標準品、sdh20和熒光分子量內標。1、y-str29個基因座的篩選通過對dys391、dys456、dys19、dys448、dys385a/b、dys392、dys389i、dys449、dys389ii、dys438、dys570、dys390、dys437、dys460、dys533、dys481、dys576、dys549、dys518、dyf387s1a/b、dys557、dys393、gatah4、dys439、dys447、dys458、dys635共29個y染色體str基因座的基因多態性和突變率的研究，最后篩選出，共29個y-str基因座。每個基因座相應信息表如下：2、五色熒光系統的建立法醫實驗室采用熒光檢測技術的具體過程為：激光轟擊連接在dna末端的熒光集團(染料)，熒光集團吸收能力后發出較低能量的光，用濾光片收集特定波長范圍的發射光，用光電倍增管或電耦合裝置用以收集和放大來自熒光集團的信號，并將其轉化為電信號，最終生成毛細管電泳的峰圖。3、29y-str個基因座排布第一組，dys391、dys456、dys19、dys448、dys385a、dys385b；第二組，dys392、dys389i、dys449、dys389ii、dys438、dys570；第三組,dys390、dys437、dys460、dys533、dys481、dys576；第四組,dys549、dys518、dyf387s1a、dyf387s1b、dys557；第五組,dys393、gatah4、dys439、dys447、dys458、dys635。將五組引物分別用紅色pet、黃色ned、藍色fam、綠色vic、和紫色熒光素vig標記其5'端。4、調整pcr反應混合液在pcr擴增體系中，對mg2+濃度、dntps濃度兩個因素設計正交試驗進行優化，最終將，mg2+濃度定位2.5mm，dntps濃度為0.25mm，tris-hcl濃度為100mm，kcl濃度為100mm，并且利用上述材料制備成pcr反應混合液。最終pcr體系組成見下表：5、調整pcr反應程序及pcr擴增本發明為包裝不同檢材的適應性及不同退火溫度的耐受性，分別對循環數和退火溫度進行測試。其中，循環數測試了27、28、29、30、31、32個循環，最佳為29和循環；分別測試了58℃、59℃、60℃、61℃、62℃，最佳溫度為62℃。最終反應擴增程序為：94℃2min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共29個循環；72℃10min；4℃forever。6、pcr擴增反應取反應混合液、引物混合液按照下表配成混合液，震蕩混勻后分裝至pcr反應管中，每管25ul。綜上所述，本發明提供的人類y-str29個基因座熒光標記復合擴增試劑盒，所述的試劑盒包含29對str基因座的特異性擴增引物，所述的29對str基因座的特異性擴増引物分為五組，分別采用不同的熒光色標記，即五組引物依次分別用紅色pet、黃色ned、藍色fam、綠色vic、和紫色熒光素vig標記其5'端，擴增上述基因座的引物，本發明通過上述基因座的特異性引物的設計以及獨特的基因座組合熒光標記方式，使得本發明復合擴增體系中，僅采用五種標記就可以在同一個復合擴增體系中同時擴增本發明的29個基因座，靈敏度非常高。與現有技術相比，本發明的熒光標記復合擴增試劑盒更針對中國人群，多態性高、性能穩定、操作簡單和能同時檢測更多基因座的檢測體系。此外，本試劑盒具有較好的溫度耐受性，使用不同質量的pcr儀均可獲得較好的擴增結果。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12