專利名稱：熒光標記多肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，尤其涉及一種熒光標記多肽及其制備方法和應用。
背景技術：
組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDAC)是一類從組蛋白賴氨酸殘基上去除ε-N-乙?；拿讣易濉Ｕ婧松镏校旧|的基本單位是核小體。核小體由核心組蛋白(Η2Α，Η2Β, Η3，Η4)構成的八聚體、一段146個堿基的DNA片段和連接組蛋白Hl組成。核心組蛋白的C端疏水氨基酸位于核小體的內部，N端氨基酸則伸出核小體外，并被各種組蛋白修飾酶進行特異性位點的修飾，包括磷酸化、乙?；⒓谆头核鼗取Ｍㄟ^對組蛋白賴氨酸殘基的修飾并導致組蛋白過乙酰化，組蛋白去乙酰化酶可以調控特定基因的表達并參與各種生理病理過程的調控。 人類組蛋白去乙?；讣易骞灿?8個成員，并根據其與酵母組蛋白去乙?；傅耐葱苑殖伤念?，其中一類和二類被認為是“典型的”組蛋白去乙?；福涮攸c是可以被trichostation A抑制；第三類酶的催化活性依賴于NAD+輔因子的存在，并不受trichostation A的影響；第四類酶(HDACll)的催化中心保留了和一二類組蛋白去乙?；赶嗤幕鶊F。組蛋白去乙?；敢种苿┲饕ㄟ^調節細胞凋亡、誘導活性氧生成、阻止血管生成等作用機制發揮其抗癌作用，并已成為全球抗腫瘤藥物的研究的熱點。目前只有兩種組蛋白去乙?；敢种苿￢orinostat和Romidepsin被美國食品藥品監督管理局批準并被用于治療表皮T細胞淋巴瘤。因此，建立一個準確高效的組蛋白乙酰化酶抑制劑體外篩選平臺在此類藥物的臨床前研發中顯得十分重要和急迫。目前體外篩選組蛋白乙?；敢种苿w外多使用市售試劑盒來完成，其檢測是通過兩步法來實現的，第一步是將去乙?；负偷孜锓跤磻コ孜锷系囊阴；?，第二步是加入特異識別并切割去乙酰基化的底物的酶，并釋放出有色或者熒光基團用于檢測。這種體外篩選方法成本較高，且由于反應過程需要加入一步酶偶聯反應作為顯色反應，在篩選過程中容易得到假陽性或者假陰性結果，從而對后續的研發工作帶來許多障礙，并不適用于現代醫藥產業新藥研發的需求。

發明內容
本發明的目的，就是為了解決上述現有技術存在的問題，提供一種熒光標記多肽及其制備方法和應用。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案一種熒光標記多肽，其氨基酸序列為TSRHK(Ac)-CONH2,該氨基酸序列第五位賴氨酸殘基上的乙?；鶊F可被組蛋白去乙?；缸R別并切除。上述熒光標記多肽的制備方法，包括以下順序進行的步驟A、取 Fmoc-Lys (Ac)-Rink 酸胺 4_ 甲基二苯甲胺樹脂(Fmoc-Lys(Ac)-RinkAmide-MBHAResin)置于反應容器中，以N，N_ 二甲基甲酰胺溶脹樹脂，然后用脫保護液反應2次后，抽出脫保護液；B、依次向反應容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-His(trt)-0H、苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺，振蕩反應；然后抽出反應液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干；C、向反應容器中加入脫保護液反應2次，然后抽出脫保護液，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干；D、依次向反應容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(Pbf)-0H、苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺，振蕩反應，然后抽出反應液，再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干；
E、向反應容器中加入脫保護液振蕩反應2次，然后抽出脫保護液，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干；F、依次向反應容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser (Boc)-0H、苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺，振蕩反應，然后抽出反應液，再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干；G、向反應容器中加入脫保護液振蕩反應2次，然后抽出脫保護液，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干；H、依次向反應容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Thr(tBu)_0H、苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺，振蕩反應，然后抽出反應液，再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干；I、向反應容器中加入脫保護液振蕩反應2次，然后抽出脫保護液，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干；J、依次向反應容器中加入N，N_二甲基甲酰胺、5-FAM、苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺，振蕩反應，然后抽出反應液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽出洗滌液，即得到存在于洗滌液中的熒光標記多肽，洗滌液中的熒光標記多肽再通過C18反相柱利用HPLC分離提純得到熒光標記多肽產品。上述熒光標記多肽的制備方法，其中，所述的脫保護液為含有20%哌啶的N，N_ 二甲基甲酰胺溶液。上述熒光標記多肽的應用，是以所述熒光標記多肽為底物，篩選組蛋白去乙酰化酶抑制劑。上述熒光標記多肽的應用，其中，所述篩選組蛋白去乙?；敢种苿┑姆椒ㄊ荌)將檢測化合物用DMSO梯度稀釋為化合物溶液；2)在384孔微孔板中，每孔加入I微升梯度稀釋后的化合物溶液；3)每孔加入15微升含16微摩爾/升熒光標記多肽的反應緩沖液；3)每孔加入15微升含O. 4單位SIRT I酶(或者合適濃度的其他HDAC酶)的反應緩沖液；4)放入30 V孵箱中反應60分鐘；5)每孔加入45微升反應終止液；7)使用遷移率變動實驗測量所述熒光標記多肽的轉化率并計算檢測化合物的半數抑制濃度IC50，如半數抑制濃度IC50小于10微摩爾/升，則所述檢測化合物為組蛋白去乙?；敢种苿?。上述熒光標記多肽的應用，其中，所述化合物溶液的配制方法是，取濃度為10毫摩爾/升的檢測化合物溶液，用DMSO按照半對數梯度稀釋的方法稀釋至所用終濃度的30倍濃度。上述熒光標記多肽的應用，其中，所述反應緩沖液的配制方法是，取25毫升I摩爾/升的Tris溶液，137毫升I摩爾/升的氯化鈉溶液，2. 7毫升I摩爾/升的氯化鉀溶液，I毫升I摩爾/升的氯化鎂溶液，O. I克BSA粉末以及5毫升O. I摩爾/升的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，加入蒸餾水定容至I升。上述熒光標記多肽的應用，其中，所述反應終止液的配制方法是，取100毫升I摩爾/升的HEPES緩沖液，20毫升O. 5摩爾/升的EDTA溶液，I. 33毫升30%的Bri j35溶液和I毫升5毫摩爾/升的suramin溶液,加入蒸懼水定容至I升。 上述熒光標記多肽的應用，其中，所述的化合物所用終濃度根據檢測化合物的特性和實驗設計而不同，最高終濃度為100微摩爾/升。本發明制備的熒光標記多肽可以作為組蛋白去乙?；傅牡孜铮磻笸ㄟ^遷移率變動實驗來直接檢測底物的轉化率，從而計算出檢測化合物對酶活性的抑制程度。使用本發明的熒光標記多肽作為底物來篩選去乙?；敢种苿?，由于不再需要第二步酶偶聯反應，因此與現有技術相比，具有快速(I個半小時以內得到結果)、經濟(成本為試劑盒方法的一半甚至四分之一)、直接準確(假陽/陰性率低)的特點，可用于大規模篩選化合物庫來鑒定組蛋白去乙酰化酶抑制劑。


圖I為制備多肽的HPLC分析圖；圖2為制備多肽的質譜分析圖；圖3為檢測化合物的半數抑制濃度(IC50)分析圖。
具體實施例方式實施例I熒光標記多肽的制備方法I)精確稱取10克的Fmoc-Lys (Ac) -Rink酰胺4_甲基二苯甲胺樹脂加入200毫升的反應容器中，并加入100毫升N，N-二甲基甲酰胺溶脹樹脂30分鐘，抽干，再用N，N-二甲基甲酰胺振蕩洗漆3次,每次50暈升,3分鐘I次,抽干，加入50暈升脫保護試劑(含20%哌啶的N，N- 二甲基甲酰胺)振蕩反應2次，每次15分鐘中間再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌I次，抽出脫保護液，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，抽干，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陽性。2)依次向反應容器中加入50毫升N，N- 二甲基甲酰胺，12. 65克Fmoc-His (trt)-OH，8. 30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，2. 7克I-羥基苯并三氮唑，2. 4毫升N，N-二異丙基乙胺，振蕩30分鐘，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陰性。抽出反應液，再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，每次50毫升，3分鐘I次，抽干。3)加入50毫升脫保護試劑(含20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振蕩反應2次，每次15分鐘中間再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌I次，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陽性，抽出脫保護液，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，抽干。4)依次向反應容器中加入50毫升N，N- 二甲基甲酰胺，7. 72克Fmoc-Arg(Pbf) -0H, 8. 30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，2. 7克I-羥基苯并三氮唑，2. 4毫升N，N-二異丙基乙胺，振蕩30分鐘，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陰性。抽出反應液，再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，每次50毫升，3分鐘I次，抽干。5)加入50毫升脫保護試劑(含20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振蕩反應2次，每次15分鐘中間再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌I次，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陽性，抽出脫保護液，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，抽干。6)依次向反應容器中加入50毫升N，N- 二甲基甲酰胺，9. 24克Fmoc-Ser (Boc) -0H, 8. 30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，2. 7克I-羥基 苯并三氮唑，2. 4毫升N，N-二異丙基乙胺，振蕩30分鐘，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陰性。抽出反應液，再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，每次50毫升，3分鐘I次，抽干。7)加入50毫升脫保護試劑(含20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振蕩反應2次，每次15分鐘中間再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌I次，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陽性，抽出脫保護液，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，抽干。8)依次向反應容器中加入50毫升N，N- 二甲基甲酰胺，6. 24克Fmoc-Thr (tBu)-0H，8. 30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，2. 7克I-羥基苯并三氮唑，2. 4毫升N，N-二異丙基乙胺，振蕩30分鐘，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陰性。抽出反應液，再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，每次50毫升，3分鐘I次，抽干。9)加入50毫升脫保護試劑(含20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺)振蕩反應2次，每次15分鐘中間再用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌I次，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陽性，抽出脫保護液，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，抽干。10)依次向反應容器中加入50毫升N，N_ 二甲基甲酰胺，9. 24克5_FAM，8. 30克苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，2. 7克I-羥基苯并三氮唑，2. 4毫升N，N- 二異丙基乙胺，振蕩30分鐘，取少許樹脂做茚三酮檢測，呈陰性，抽出反應液。再用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂3次，每次50毫升，3分鐘I次，抽干。11)取所得的樣品做HPLC和MS分析(圖1，圖2)以檢測制備多肽的質量。實施例2遷移率變動實驗中的化合物溶液和反應溶液的配制方法I)取濃度為10毫摩爾/升的化合物溶液，用DMSO按照半對數稀釋的方法稀釋至所用終濃度的30倍濃度，放置備用，此為化合物溶液。2)取25毫升I摩爾/升的Tris溶液，137毫升I摩爾/升的氯化鈉溶液，2. 7毫升I摩爾/升氯化鉀溶液和I毫升I摩爾/升的氯化鎂，O. I克BSA粉末以及5毫升O. I摩爾/升的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液加入750毫升蒸餾水中，并調節pH值到8. 0，再用I升的容量瓶定容至I升，并用O. 45微米孔徑的濾器過濾后備用，此為反應緩沖液。3)取100毫升I摩爾/升的HEPES緩沖液，20毫升O. 5摩爾/升EDTA溶液，I. 33毫升30% Brij 35溶液，I毫升5毫摩爾/升suramin溶液加入800毫升蒸餾水中，并調節PH值到7. 5，再用I升的容量瓶定容至I升，并用O. 45微米孔徑的濾器過濾后備用，此為反應終止液。
實施例3熒光標記多肽作為底物篩選組蛋白去乙酰化酶抑制劑的方法I)取I微升梯度稀釋后的化合物溶液加入384孔微孔板中2)每孔加入15微升含16微摩爾/升突光標記多肽的反應緩沖液。3)每孔加入15微升含O. 4單位SIRT I酶(或者合適濃度的其他HHDAC酶)的反應緩沖液。4)放入30°C孵箱中反應60分鐘(或者合適的反應時間)。5)每孔加入45微升反應終止液。6)使用遷移率變動實驗(可以使用Caliper EZ Reader II來讀取反應信號，也可以使用凝膠電泳和凝膠成像儀來分析實驗結果)測量底物的轉化率并計算化合物的半數 抑制濃度(IC50)。圖I為制備多肽的HPLC分析圖；圖2為制備多肽的質譜分析圖；圖3為檢測化合物的半數抑制濃度(IC50)分析圖。序列表<110>輝源生物科技(上海)有限公司〈120〉熒光標記多肽及其制備方法和應用〈160〉I<210>1<211>5<212>PRT〈213〉人工序列〈400〉ITSRHK (Ac) -CONH權利要求
1.一種熒光標記多肽，其氨基酸序列為TSRHK (Ac) -CONH2,該氨基酸序列第五位賴氨酸殘基上的乙?；鶊F可被組蛋白去乙酰化酶識別并切除。
2.如權利要求I所述的熒光標記多肽的制備方法，其特征在于包括以下順序進行的步驟 A、取Fmoc-Lys(Ac)-Rink 酸胺 4-甲基二苯甲胺樹脂(Fmoc-Lys(Ac)-RinkAmide-MBHAResin)置于反應容器中，以N，N-二甲基甲酰胺溶脹樹脂，然后用脫保護液反應2次后，抽出脫保護液； B、依次向反應容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-His(trt)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N- 二異丙基乙胺，振蕩反應；然后抽出反應液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干； C、向反應容器中加入脫保護液反應2次，然后抽出脫保護液，用N，N-二甲基甲酰胺洗漆樹脂，抽干； D、依次向反應容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N- 二異丙基乙胺，振蕩反應，然后抽出反應液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干； E、向反應容器中加入脫保護液振蕩反應2次，然后抽出脫保護液，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干； F、依次向反應容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(Boc)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N- 二異丙基乙胺，振蕩反應，然后抽出反應液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干； G、向反應容器中加入脫保護液振蕩反應2次，然后抽出脫保護液，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干； H、依次向反應容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Thr(tBu)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N- 二異丙基乙胺，振蕩反應，然后抽出反應液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干； I、向反應容器中加入脫保護液振蕩反應2次，然后抽出脫保護液，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽干； J、依次向反應容器中加入N，N- 二甲基甲酰胺、5-FAM、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、I-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺，振蕩反應，然后抽出反應液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，抽出洗滌液，即得到存在于洗滌液中的熒光標記多肽，洗滌液中的熒光標記多肽再通過C18反相柱利用HPLC分離提純得到熒光標記多肽產品。
3.根據權利2要求所述的熒光標記多肽的制備方法，其特征在于所述的脫保護液為含有20%哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液。
4.如權利要求I所述的熒光標記多肽的應用，其特征在于以所述熒光標記多肽為底物，篩選組蛋白去乙?；敢种苿?。
5.如權利要求4所述的熒光標記多肽的應用，其特征在于，所述篩選組蛋白去乙?；敢种苿┑姆椒ㄊ? 1)將檢測化合物用DMSO梯度稀釋為化合物溶液； 2)在384孔微孔板中，每孔加入I微升梯度稀釋后的化合物溶液；3)每孔加入15微升含16微摩爾/升熒光標記多肽的反應緩沖液；3)每孔加入15微升含去乙酰化酶的反應緩沖液；4)放入30°C孵箱中反應60分鐘；5)每孔加入45微升反應終止液；7)使用遷移率變動實驗測量所述熒光標記多肽的轉化率并計算檢測化合物的半數抑制濃度IC50，如半數抑制濃度IC50小于I微摩爾/升，則所述檢測化合物為組蛋白去乙?；敢种苿?。
6.如權利要求5所述的熒光標記多肽的應用，其特征在于所述化合物溶液的配制方法是，取濃度為10毫摩爾/升的檢測化合物溶液，用DMSO按照半對數梯度稀釋的方法稀釋至所用終濃度的30倍濃度。
7.如權利要求5所述的熒光標記多肽的應用，其特征在于所述反應緩沖液的配制方法是，取25毫升I摩爾/升的Tris溶液，137毫升I摩爾/升的氯化鈉溶液，2. 7毫升I摩爾/升的氯化鉀溶液，I毫升I摩爾/升的氯化鎂溶液，O. I克BSA粉末以及5毫升O. I摩爾/升的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，加入蒸餾水定容至I升。
8.如權利要求5所述的熒光標記多肽的應用，其特征在于所述反應終止液的配制方法是，取100毫升I摩爾/升的HEPES緩沖液，20毫升O. 5摩爾/升的EDTA溶液，I. 33毫升30%的Bri j35溶液和I毫升5毫摩爾/升的suramin溶液，加入蒸餾水定容至I升。
9.如權利要求6所述的熒光標記多肽的應用，其特征在于所述的化合物所用終濃度根據檢測化合物的特性和實驗設計而不同，最高終濃度為100微摩爾/升。
全文摘要
一種熒光標記多肽，其氨基酸序列為TSRHK(Ac)-CONH2，以Fmoc-Lys(Ac)-Rink酰胺4-甲基二苯甲胺樹脂等為原料制備而成。本發明制備的熒光標記多肽可以作為組蛋白去乙酰化酶的底物，反應后通過遷移率變動實驗來直接檢測底物的轉化率，從而計算出檢測化合物對酶活性的抑制程度，來篩選和鑒定組蛋白去乙酰化酶抑制劑。使用本發明的熒光標記多肽作為底物來篩選去乙?；敢种苿?，由于不再需要第二步酶偶聯反應，與現有技術相比，具有快速(1個半小時以內得到結果)、經濟(成本為試劑盒方法的一半甚至四分之一)、直接準確(假陽/陰性率低)的特點，并可用于大規模篩選化合物庫來鑒定組蛋白去乙?；敢种苿?。
文檔編號C12Q1/34GK102924570SQ20121037870
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月8日 優先權日2012年10月8日
發明者王柏秋, 孫凌冰, 王睿, 余佳凌 申請人:輝源生物科技(上海)有限公司