本發明屬于微生物
技術領域：
。更具體地，本發明涉及一株改善肝功能的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum，l.plantarum)zy001及其在發酵乳中的應用。
背景技術：
：新疆喀什地區具有優越的草資源條件和種植業豐富的秸稈資源，擁有驢品種、數量資源優勢，為驢產業發展創造了得天獨厚的條件。2008年，新疆驢被列為國家級畜禽遺傳資源保護品種。驢奶作為驢養殖業的主要副產品之一，不僅具有較高的營養價值，而且具有較廣泛的藥用價值。其它奶源相比，驢奶是一種低脂肪、低膽固醇、高鈣、富硒、美容、抗衰老的天然乳品，驢奶中各營養成分的比例最為接近人乳。驢奶中含有大量的表皮細胞生長因子(egf)，egf能增強人體的免疫力、抵抗力；可以促進上皮細胞營養代謝，保護皮膚及預防皮膚由于各種原因導致的損失，有促進皮下膠原細胞再生功能。國內外臨床研究表明，益生乳酸菌可逆轉腸內菌群失衡，當腸道粘膜組織受損嚴重，增加富含修復腸上皮細胞的特殊營養物質，如多糖類益生元，藥食同源功能組分等，對恢復腸道功能有確切的增益作用，可減少腸源性感染和器官功能衰竭的發生率，是扭轉疾病急性轉危的關鍵環節，從而降低病死率；同時可減少抗生素的使用與住院時間，降低醫療費用，微生態營養治療已為疾病治療打開一扇新窗口。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，常存在于發酵的蔬菜和果汁中，在食品、青貯飼料及醫療保健等領域受到越來越多的關注。該菌株屬于同型發酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、l-山梨糖、乳糖、纖維二糖、木糖、蜜二糖、果糖、核糖、葡萄糖酸鈉產酸，但發酵葡萄糖和葡萄糖酸鈉均不產氣。利用該菌株發酵乳糖產酸處理乳清中乳糖轉化時，具有其他菌種無法比擬的優越性，它既可以高轉化率地利用乳糖轉化為葡萄糖，又可以利用乳清中殘留蛋白質。本發明的特色是：1、菌種來源于新疆喀什地區，從新疆土法驢酸奶中分離得到的乳酸菌；2、植物乳桿菌作為人體腸道中的益生菌群，具有維持腸道內菌群平衡，提高機體免疫力和改善肝功能等多種功能；3、cn104770469a提供的產品方案為以純驢奶或加入其他不含酪蛋白的天然產物提取物水溶液的驢奶為原料發酵生產酸奶制品，其中由于驢奶酪蛋白含量低的原因不能實現酸奶的制備，可歸為乳酸飲料的一種。本發明的酸奶制備過程是以植物乳桿菌或植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以1～3∶1～2∶1配比配制發酵種子，接種至驢奶∶牛奶＝2～4∶8～6的混合乳原料中，發酵獲得凝乳型驢奶發酵乳產品。技術實現要素：[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一株改善肝功能的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum，l.plantarum)zy001。本發明的另一個目的是提供所述的植物乳桿菌zy001在發酵乳中的應用。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一株植物乳桿菌zy001，該菌株已于2016年09月02日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號分別為cgmcc13505。根據本發明的一種優選實施方式，所述的乳類發酵制品是發酵乳。根據本發明的一種優選實施方式，植物乳桿菌zy001及其在發酵乳中的應用制備步驟如下：(1)從新疆土法驢酸奶中分離得到乳酸菌zy001，經鑒定是植物乳桿菌，即植物乳桿菌zy001；(2)以驢奶和牛奶混合乳為原料，接種植物乳桿菌zy001發酵獲得單菌驢奶發酵乳；(3)以單菌驢奶發酵乳灌胃酒精肝損傷sd大鼠，測定谷草轉氨酶(ast)和谷丙轉氨酶(alt)含量，確定植物乳桿菌zy001改善肝功能的功效；(4)將植物乳桿菌zy001、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以1～3∶1～2∶1配比配制發酵種子，接種至驢奶∶牛奶＝2～4∶8～6的原料中，發酵獲得驢奶發酵乳產品。步驟(2)中所述的發酵溫度為42℃，發酵終點為ph4.0，即凝乳時間；步驟(3)中所述動物模型每組10只，分別為空白組、生理鹽水對照組、植物乳桿菌zy001發酵乳實驗組及混合乳組；給予方式為灌胃；以自動血液生化分析儀測定生化指標血清中谷草轉氨酶(ast)和谷丙轉氨酶(alt)的活性。本發明方案的實施，至少具有以下優勢：根據本發明方法，發酵菌種分離于肝病發病率較低的新疆喀什地區的土菌發酵驢奶，經動物實驗證實，該菌具有一定的改善肝功能功效。本發明的應用主原料之一為驢奶，驢奶具有增強免疫力，美容、抗衰老的功效，經植物乳桿菌zy001發酵后，更易被人體吸收、代謝，發酵產品具備驢奶和植物乳桿菌zy001的雙重功效。與cn106190930a不同的是本發明提供的菌種為自行分離的擁有自主知識產權的菌種，已進行專利保藏；與cn104770469a相比，本發明提供的產品為真正意義上的發酵乳品，呈凝乳狀。具體實施方式下面將結合具體實施例來進一步對本發明作詳細描述，以使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚。以下實施例僅用于舉例說明，并不對本發明構成任何限制。實施例1植物乳桿菌zy001是從新疆牧民家庭自然發酵酸驢奶中分離、篩選出的一株具有優良發酵特性的植物乳桿菌。將zy001劃線接種至mrs瓊脂培養基，42℃培養24h，在該條件下進行連續傳代培養25代，未見顯著性變異。挑取zy001菌落，畫線接種于mrs液體培養基上，在溫度37℃與厭氧的條件下培養48h；待菌落形成后，以1％的接種量接種mrs液體培養基，37℃條件下擴大培養24h；再次畫線于mrs瓊脂培養基上，確認其為純培養物后穿刺于mrs半固體培養基上，4℃下保存。觀察記錄純培養物的菌落形態、革蘭氏染色細胞形態特征，并進行常規的接觸酶和氧化酶實驗。將革蘭氏陽性、接觸酶和氧化酶試驗陰性和細胞形態呈桿狀的菌株暫時命名為乳桿菌。該菌株在mrs培養基上形成淺黃色的圓形菌落凸起，表面光滑，細密，在顯微鏡下觀測的細胞多為細長桿狀。本發明使用的mrs瓊脂培養基由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸合硫酸鎂、20g葡萄糖、1ml吐溫80、5g蘭水合乙酸納、2g三水合磷酸氫二鉀、0.58g七水合硫酸鎂、0.25g一水合硫酸錳、6g瓊脂與1000ml蒸餾水組成，其ph6.2-6.6。本發明使用的mrs液體培養基是由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸氫二胺、20g葡萄糖、1ml吐溫80、5g三水合乙酸納、2g三水合磷酸氫二鉀、0.58g七水合硫酸鎂、0.25g一水合硫酸錳與1000ml蒸餾水組成，其ph6.2-6.6。以mrs液體培養基重量計2％的接種量，將分離純化的菌種在37℃條件下擴大培養，接著對菌種培養物進行碳水化合物產酸(api50ch)反應，鑒定菌種的理化性質。用試劑盒提取菌種dna，設計16srdna和phes基因序列的引物并進行pcr反應及測序。經過16srdna和phes基因序列同源性比對，所述菌株與lactobacillusplantarumwcfs1(sequenceid：nc_004567.2)有99％的同源性。經過對多項實驗數據的綜合分析，鑒定菌株zy001為植物乳桿菌。表1為菌種zy001細胞形態和生理生化鑒定結果。實施例2：將活化的植物乳桿菌zy001接種于mrs液體培養基，37℃培養24h，以4％接種量接種純牛奶，42℃靜置培養至凝乳，充分攪拌后，取凝乳發酵液以4％接種量接種至驢奶∶牛奶＝3∶7的混合乳中，42℃培養至凝乳，獲得植物乳桿菌zy001發酵乳，凝乳時間為12h，凝乳時ph為4.0。獲得植物乳桿菌zy001發酵乳及配置的未發酵的混合乳用于后續動物實驗。實施例3：大鼠建酒精性肝損傷模型將40只sd大鼠(雌雄各半)機分為模型組和空白組，體重180-200g，在溫度22-24℃，濕度30-40％，光照和黑暗時間為12h的環境中飼養，正常對照組與模型組動物一樣給予基礎飲食，模型組按0.2ml/100g體質量的劑量灌胃50％的乙醇溶液12ml/kg*bw，每天1次；正常對照組給予等體積蒸餾水，持續30天后，以自動血液生化分析儀測定生化指標血清中谷草轉氨酶(ast)和谷丙轉氨酶(alt)的活性。將建模成功的sd大鼠隨機分組，每組10只，分別為空白組、生理鹽水對照組、植物乳桿菌zy001發酵乳實驗組及混合乳組；給予方式為灌胃，灌胃量5ml/次，每日2次，2周后以自動血液生化分析儀測定生化指標血清中谷草轉氨酶(ast)和谷丙轉氨酶(alt)的活性，結果見表2。經動物實驗發現，以單菌驢奶發酵乳灌胃乙醇肝損傷sd大鼠，可顯著改善ast和alt的表達，由此可見，植物乳桿菌zy001具備改善肝功能的功效。實施例4：驢奶發酵乳的制備以驢奶和牛奶混合乳為原料，底物配比2∶8，3∶7，4∶6。分別活化培養公司前期保存鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以及植物乳桿菌zy001，將三種菌于mrs培養基中37℃培養24h后，4％接種于無菌純牛奶，42℃靜置培養至凝乳后按植物乳桿菌zy001、鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌＝1∶1∶1，1∶2∶1，2∶1∶1，2∶2∶1；3∶1∶1，3∶2∶1各種配比接種驢奶牛奶混合乳(2-4∶8-6)，42℃靜置培養至凝乳，獲得不同配比的驢奶發酵乳產品。表1菌種zy001細胞形態和理化實驗結果表注：+表示陰性反應；-表示陰性反應。圖1菌種zy00116srdna基因序列測序結果atacatgcagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagttatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaaggtgggacagatgattagggtgaagtcgtaacaag圖2菌種zy001phes基因序列測序結果aagacgtgctactacgcacgcagacgtctgctgatcagccgcggtcacttgaaaatcacgatttttctaaaggaccgctgaaggtcttgtcacctggccgcgtttatcggcgtgatacggatgatgcaacccattcccatcaatttcatcaaattgaagggttagtcgtggacaagcatattacgatggctgatttgaagggcaccttaattctggttgccaagactttgtttggcgatcaattcgagtttcggctacggccaagcttctttccattcacggaaccatccgtagaagctgatgtaacttgctttaattgcaatggcaagggctgtgcaatctctaagcaaacgggttggatcgaagtactgggtgccggcatggttcacccccacgtgttagaaatgtctggcattgatccagaagaatatggtggctttgctttcgggcctagg表2發酵乳對酒精性肝損傷大鼠模型的酶指標組別ast(u/l)alt(u/l)正常組19.82±4.3226.21±4.38模型組51.21±6.3846.89±6.34生理鹽水對照組50.76±4.7545.86±5.56混合乳組45.25±6.7841.77±7.18植物乳桿菌zy001發酵乳實驗組36.53±6.7536.45±6.17當前第1頁12