本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種fcγriib基因敲除的mdsc及其作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤發(fā)生時(shí)共同髓系祖細(xì)胞分化過(guò)程受阻，造成處于不同分化階段的髓系祖細(xì)胞及未成熟髓系細(xì)胞大量擴(kuò)增并活化為具有免疫抑制功能的髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derivedsuppressorcell,mdsc)，在骨髓、外周血、脾臟、淋巴結(jié)和腫瘤組織中大量聚集。mdsc主要通過(guò)抑制t細(xì)胞發(fā)揮其強(qiáng)大的免疫抑制功能，如通過(guò)表達(dá)精氨酸酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inos)抑制t細(xì)胞增殖；通過(guò)分泌il-10或tgf-β誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞產(chǎn)生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均表明，mdsc擴(kuò)增與多種腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，并降低腫瘤免疫治療的效果。因而，調(diào)控mdsc的分化及表型功能是腫瘤免疫治療的新策略。新近的研究顯示：在特定情況下，如抗磷脂酰絲氨酸抗體能夠誘導(dǎo)腫瘤組織中mdsc向免疫刺激表型極化；使用shp-1抑制劑，腫瘤組織和脾臟中mdsc均能極化為免疫刺激表型并進(jìn)行抗腫瘤應(yīng)答。因此，改變mdsc的極化狀態(tài)，使其向免疫刺激表型極化是腫瘤免疫治療的新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)的mdsc。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供上述fcγriib基因敲除的mdsc的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

給fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)小鼠皮下注射1×10⁶個(gè)肺癌細(xì)胞株3ll細(xì)胞或黑色素瘤細(xì)胞株b16f10細(xì)胞，3周后無(wú)菌分離獲取小鼠脾臟，用無(wú)菌針芯將脾臟磨碎，經(jīng)400目鋼網(wǎng)濾過(guò)并收集單細(xì)胞，tris-nh4cl裂解紅細(xì)胞，pbs洗滌2遍，cd11b磁珠4℃標(biāo)記15min后，過(guò)分選柱陽(yáng)性選擇cd11b⁺細(xì)胞，即可制備得到fcγriib基因敲除的mdsc。

上述制備方法中fcγiirb^-/-小鼠優(yōu)選c57bl/6背景的小鼠。

上述制備得到的fcγriib基因敲除的mdsc經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)cd11b⁺gr-1⁺mdsc純度在90％以上。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供上述fcγriib基因敲除的mdsc在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述抗腫瘤藥物優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療肺癌、黑色素瘤。

本發(fā)明所述的pbs的制備方法：將nacl(16g)、nahpo4(5.78g)、kh2po4(0.27g)和kcl(0.4g)溶于2000ml三蒸水中，用鹽酸調(diào)ph至7.4，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明所采用的具體方法是：分別給野生(wildtype,wt)小鼠和fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)小鼠皮下注射1×10⁶個(gè)肺癌細(xì)胞株3ll細(xì)胞或黑色素瘤細(xì)胞株b16f10細(xì)胞，3周后取小鼠的脾臟，免疫磁珠分選cd11b⁺gr-1⁺mdsc。部分mdsc裂解后檢測(cè)精氨酸酶活性，部分mdsc鋪板后24小時(shí)，收集上清，檢測(cè)上清中一氧化氮(no)、il-10和tnf-α的分泌情況。結(jié)果在兩種荷瘤模型中均發(fā)現(xiàn)：與wtmdsc相比，fcγiirb^-/-mdsc精氨酸酶活性和il-10分泌明顯下降，inos活性和tnf-α分泌明顯增高，提示fcγriib缺陷誘導(dǎo)mdsc向免疫刺激型極化。為了進(jìn)一步證實(shí)fcγiirb^-/-mdsc具有抗腫瘤效應(yīng)，分別給wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠皮下注射1×10⁶個(gè)3ll細(xì)胞，3周后取小鼠的脾臟，磁珠分選wtmdsc和fcγiirb^-/-mdsc，備用。給c57bl/6小鼠皮下注射1×10⁵個(gè)3ll細(xì)胞，在注射3ll細(xì)胞后的第7天、第14天和第21天分別給荷瘤小鼠靜脈過(guò)繼回輸wtmdsc和fcγiirb^-/-mdsc，同時(shí)設(shè)靜脈注射pbs緩沖液的對(duì)照。檢測(cè)荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過(guò)繼回輸wtmdsc可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而過(guò)繼回輸fcγiirb^-/-mdsc則延緩腫瘤的生長(zhǎng)(圖1)，提示fcγiirb^-/-mdsc具有抗腫瘤效應(yīng)。

本發(fā)明首次提出fcγiirb在mdsc向免疫刺激表型極化過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，從而影響腫瘤的進(jìn)展，為研制以fcγiirb為靶標(biāo)的新型腫瘤防治手段提供基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1fcγriib^-/-b16f10荷瘤小鼠mdsc細(xì)胞因子分泌情況

圖2fcγriib^-/-3ll荷瘤小鼠mdsc細(xì)胞因子分泌情況

圖3fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾臟mdsc具有抗腫瘤效應(yīng)

圖4fcγriib缺陷降低3ll荷瘤小鼠的死亡率

具體實(shí)施方式

為了便于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，下面提供的實(shí)施例對(duì)其做了更詳細(xì)的說(shuō)明。但是這些實(shí)施例僅供更好的理解發(fā)明而并非用來(lái)限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┰瓌t，本發(fā)明的實(shí)施方式不限于以下內(nèi)容。

有關(guān)原材料說(shuō)明：

(1)3ll和b16f10細(xì)胞株來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心(americantypeculturecollection,atcc)，由本室保種。

(2)小鼠cd11b分選磁珠購(gòu)自德國(guó)美天妮公司。

(3)il-10和tnf-α的elisa檢測(cè)試劑盒購(gòu)自達(dá)科為公司。

(4)c57bl/6小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

(5)fcγiirb基因缺陷小鼠來(lái)源于美國(guó)jackson實(shí)驗(yàn)室，由本室保種。

(6)檢測(cè)一氧化氮的griess試劑購(gòu)自美國(guó)sigma公司。

(7)檢測(cè)精氨酶酶活性的試劑盒購(gòu)自美國(guó)bioassay公司。

(一)fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾臟mdsc向免疫刺激表型極化

(1)mdsc的獲取

分別給c57bl/6背景的wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠背部皮下注射1×10⁶個(gè)3ll細(xì)胞或b16f10細(xì)胞，3周后無(wú)菌分離獲取小鼠脾臟，用無(wú)菌針芯將脾臟磨碎，經(jīng)400目鋼網(wǎng)濾過(guò)并收集單細(xì)胞，tris-nh4cl裂解紅細(xì)胞，pbs洗滌2遍，cd11b磁珠4℃標(biāo)記15min后，過(guò)分選柱陽(yáng)性選擇cd11b⁺細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)cd11b⁺gr-1⁺mdsc純度在90％以上。

(2)mdsc精氨酸酶和分泌細(xì)胞因子檢測(cè)

取1×10⁶個(gè)mdsc，用細(xì)胞裂解液裂解后，利用bioassay公司的精氨酸酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)精氨酸酶活性。另將磁珠分選得到的mdsc用含10％fbs的1640培養(yǎng)液重懸至1×10⁶/ml的密度，鋪至細(xì)胞培養(yǎng)板中，24小時(shí)后，收集上清，griess試劑檢測(cè)上清中no的水平，elisa法檢測(cè)il-10和tnf-α的表達(dá)水平。在來(lái)源于3ll和b16f10荷瘤小鼠的mdsc中均發(fā)現(xiàn)，與wtmdsc相比，fcγiirb^-/-mdsc精氨酸酶活性和il-10分泌明顯下降，inos活性和tnf-α分泌明顯增高(圖1、圖2)，提示fcγriib缺陷誘導(dǎo)mdsc向免疫刺激型極化。

(二)fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾臟mdsc具有抗腫瘤效應(yīng)

(1)mdsc的獲取

分別給c57bl/6背景的wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠背部皮下注射1×10⁶個(gè)3ll細(xì)胞，3周后無(wú)菌分離獲取小鼠脾臟，用無(wú)菌針芯將脾臟磨碎，經(jīng)400目鋼網(wǎng)濾過(guò)并收集單細(xì)胞，tris-nh4cl裂解紅細(xì)胞，pbs洗滌2遍，cd11b磁珠4℃標(biāo)記15min后，過(guò)分選柱陽(yáng)性選擇cd11b⁺細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)cd11b⁺gr-1⁺mdsc純度在90％以上。

(2)mdsc過(guò)繼回輸給3ll成瘤小鼠

給c57bl/6小鼠皮下注射1×10⁵個(gè)3ll細(xì)胞，在注射3ll細(xì)胞后的第7天、第14天和第21天分別給荷瘤小鼠靜脈過(guò)繼回輸(1)中磁珠分選得到的5×10⁶個(gè)wtmdsc或fcγiirb^-/-mdsc，同時(shí)設(shè)靜脈注射pbs的對(duì)照。檢測(cè)荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過(guò)繼回輸wtmdsc可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而過(guò)繼回輸fcγiirb^-/-mdsc則延緩腫瘤的生長(zhǎng)，提示fcγiirb缺陷后的mdsc具有抗腫瘤效應(yīng)(圖3)。

(3)fcγriib缺陷降低3ll荷瘤小鼠的死亡率

在檢測(cè)3ll腫瘤生長(zhǎng)情況的同時(shí)，我們同樣觀察了wt和fcγiirb-/-荷瘤小鼠的死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與wt小鼠相比，fcγiirb-/-小鼠死亡率明顯下降，提示fcγiirb缺陷對(duì)小鼠腫瘤致死有保護(hù)作用(圖4)。