本發(fā)明涉及一種南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，具體涉及一種顯著提高了南瓜游離小孢子胚性愈傷誘導(dǎo)效率、促進了南瓜花培育種體系建立的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，屬于蔬菜培育高新技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
南瓜（cucurbitamoschata）屬于葫蘆科南瓜屬的一年生蔓性草本植物，起源于美洲，在16世紀(jì)中葉明中期傳入中國。南瓜全球目前栽培種主要有5個：中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜、灰籽南瓜和黒籽南瓜，在中國主要是栽培前3種。南瓜是人類最早栽培的古老作物之一，在公元前4050年就開始了美洲南瓜的栽培，公元前5000～3000年就有了中國南瓜和墨西哥南瓜的殘片存在。
南瓜的營養(yǎng)、保健與藥用價值較高，古代名醫(yī)李時珍在《本草綱目》中對南瓜的作用有如下記載“補中，補肝氣，益心氣，益肺氣，益精氣”，凡久病氣虛、脾胃虛弱、癥見氣短倦怠、食少腹脹、水腫尿少者宜用。近年來的研究結(jié)果亦表明，南瓜的營養(yǎng)成分豐富，其營養(yǎng)成分為水分90.24%、蛋白質(zhì)0.65%、脂肪0.13%、碳水化合物6.08%、纖維2.15%、灰分0.73%，同時還含有豐富的胡蘿卜素、維生素b、維生素c、維生素e、精氨酸、天門冬氨酸、腺嘌呤、果膠、甘露醇、葉紅素、葉黃素及鈣、鉀、鋅、鉻等礦物質(zhì)，特別是稀有氨基酸瓜氨酸含量達20.9mg/100g，果膠含量占南瓜干物質(zhì)的7%-17%，脂肪含量卻非常低。南瓜具有多種食療保健作用和藥用價值，近年來，國內(nèi)外研究表明，南瓜具有降血糖、降血脂、解毒、保肝腎、防治癌癥及肥胖癥等保健與藥用功效。隨著人們對南瓜認識的不斷加深，國內(nèi)外逐漸開始對南瓜進行綜合開發(fā)利用，目前市場上出現(xiàn)的系列南瓜產(chǎn)品有南瓜粉、南瓜醬、南瓜罐頭、南瓜果脯、三合味南瓜片、南瓜蜜錢瓜干、南瓜晶、南瓜糊、南瓜糕點、南瓜飲料、南瓜冰淇淋、什錦瓜果、南瓜果凍、南瓜醬油、南瓜火腿、南瓜營養(yǎng)汁等多種品種。
在我國，南瓜的保健作用正漸漸被人們認識了解，南瓜食品越來越受到人們的喜愛。南瓜對環(huán)境適應(yīng)力極強，極易生長，在我國各地普遍栽培，而且運輸和保存比較方便。南瓜在中國的種植面積為76萬hm2，總產(chǎn)量為1616萬噸，面積和總產(chǎn)量分別占全世界的10.3%和20%，我國是南瓜生產(chǎn)世界第一大國。開發(fā)南瓜產(chǎn)品，開展南瓜深加工的研究，對發(fā)展南瓜的種植及豐富保健食品市場都有較大的意義。
隨著南瓜國際國內(nèi)市場需求的緊俏，優(yōu)質(zhì)、抗病、豐產(chǎn)的南瓜良種培育成為蔬菜培育科研人員的研究主題之一。南瓜是異花授粉植物，雜交優(yōu)勢非常明顯，目前主要采用雜交育種方法進行南瓜新品種培育。傳統(tǒng)雜交育種方法存在周期長、效率低等突出問題，育成一個穩(wěn)定優(yōu)良自交系一般需要6-8年，甚至更長時間，選育自交系非常費事、費工。近年來隨著人工成本的增加，常規(guī)育種的不足在實際工作中日漸明顯。因此，迫切需求南瓜育種的新途徑和新方法。
單倍體育種與常規(guī)多代自交獲得純系相比，具有周期短、效率高、純系穩(wěn)定等特點。游離小孢子培養(yǎng)是單倍體育種技術(shù)中快速獲得純系的一種有效方法，同單倍體育種技術(shù)中的花藥培養(yǎng)相比，游離小孢子培養(yǎng)消除了小孢子和花藥壁、級鏈層細胞之間可能存在的營養(yǎng)競爭，往往培養(yǎng)成功的基因型多，胚狀體誘導(dǎo)頻率也高，同時去除了花藥壁、級鏈層細胞等體細胞再生植株的干擾，從而可以提高選擇的準(zhǔn)確性，提高育種效率和品種質(zhì)量。
國內(nèi)外學(xué)者對影響蔬菜游離小孢子培養(yǎng)的一些因素進行了研究，取得了顯著的進展，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和改進培養(yǎng)方法，使部分蔬菜材料小孢子胚誘導(dǎo)率有了提高，部分蔬菜種花培育種體系得以建立。但是南瓜游離小孢子培養(yǎng)研究進展緩慢，利用這項技術(shù)進行南瓜育種的研究鮮見報道，主要原因是小孢子胚性愈傷誘導(dǎo)率低而不穩(wěn)定，直接限制了南瓜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種上的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種顯著提高了南瓜游離小孢子胚性愈傷誘導(dǎo)效率、促進了南瓜花培育種體系的建立的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：
一種南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于：所述南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方如下：
kno380-90mg/l，mgso4?7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2?4h2o160-200mg/l，mnso4?4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4?7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4?7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4?2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4?5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2?6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，l-谷氨酰胺450-550mg/l，維生素b10.9-1.1mg/l，維生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，煙酸4.5-5.5mg/l，肌醇160-180mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，環(huán)鳥苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基亞硝基脲1.2-1.8g/l，蔗糖55-65g/l，植物凝膠3.0-3.5g/l，6-ba0.15-0.25mg/l，naa0.3-0.4mg/l，甘露醇10-14g/l，聚乙二醇140-180mg/l，水解蛋白1.0-1.4g/l，植物硫化激動素psk-α25-35pmol/l，ph5.4-5.8。
所述的南瓜游離小孢子的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：
將南瓜種子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧長至3-4米后進入初花期，選擇單核晚期南瓜花蕾進行取材，置于4℃冰箱內(nèi)低溫預(yù)處理1-2d，接種前，將花蕾轉(zhuǎn)移入超凈工作臺無菌燒杯中，倒入70%酒精進行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗3次；瀝干水分后，在b5液體洗滌培養(yǎng)基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子；懸浮液經(jīng)50μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液于10ml離心管，850rpm下離心3min，沉淀物加5mlb5洗滌培養(yǎng)基，搖勻，850rpm下離心2min，重復(fù)兩次，所得沉淀物即為南瓜游離小孢子；將南瓜游離小孢子轉(zhuǎn)移入南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，33℃熱激處理48h后轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)直至胚性愈傷組織形成。
所述的單核晚期南瓜花蕾的選材標(biāo)準(zhǔn)為：測量花蕾的縱莖和橫莖長度并計算縱橫比，取材縱橫莖之比為2.4-2.6的南瓜花蕾。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點：
本發(fā)明根據(jù)禾本科和茄科小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，針對于南瓜游離小孢子的孢子體發(fā)育特性，繼續(xù)優(yōu)化并組合基本培養(yǎng)基配比，調(diào)整基本培養(yǎng)基的組配，有利于南瓜游離小孢子的誘導(dǎo)；采用低含量的植物凝膠，使配制成的培養(yǎng)基半固體化，對南瓜游離小孢子的誘導(dǎo)更有利；發(fā)掘和試驗針對于提高南瓜游離小孢子成胚誘導(dǎo)能力的有機添加物和無機添加物，agno3、腺嘌呤、環(huán)鳥苷酸、谷胱甘肽、甲基亞硝基脲、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激動素psk-α等物質(zhì)的合適濃度的添加，均不同程度的提高了南瓜游離小孢子的誘導(dǎo)率。
本發(fā)明所提供的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是在現(xiàn)有其它蔬菜種的研究基礎(chǔ)之上創(chuàng)造性改良的成果，是經(jīng)過大量單因子、多因子試驗所篩選的最優(yōu)組合，我們進行了大量的實驗研究亦得出本發(fā)明的組分配比是最優(yōu)的。采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基可以大大提高游離南瓜小孢子胚性愈傷的誘導(dǎo)效率，因此具有較高的產(chǎn)業(yè)推廣價值。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
一種南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于：所述南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方如下：
kno380-90mg/l，mgso4?7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2?4h2o160-200mg/l，mnso4?4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4?7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4?7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4?2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4?5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2?6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，l-谷氨酰胺450-550mg/l，維生素b10.9-1.1mg/l，維生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，煙酸4.5-5.5mg/l，肌醇160-180mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，環(huán)鳥苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基亞硝基脲1.2-1.8g/l，蔗糖55-65g/l，植物凝膠3.0-3.5g/l，6-ba0.15-0.25mg/l，naa0.3-0.4mg/l，甘露醇10-14g/l，聚乙二醇140-180mg/l，水解蛋白1.0-1.4g/l，植物硫化激動素psk-α25-35pmol/l，ph5.4-5.8。
南瓜游離小孢子的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：
將南瓜種子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧長至3-4米后進入初花期，選擇單核晚期南瓜花蕾進行取材，單核晚期南瓜花蕾的選材標(biāo)準(zhǔn)為：測量花蕾的縱莖和橫莖長度并計算縱橫比，取材縱橫莖之比為2.4-2.6的南瓜花蕾；然后將選材的南瓜花蕾置于4℃冰箱內(nèi)低溫預(yù)處理1-2d，接種前，將花蕾轉(zhuǎn)移入超凈工作臺無菌燒杯中，倒入70%酒精進行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗3次；瀝干水分后，在b5液體洗滌培養(yǎng)基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子；懸浮液經(jīng)50μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液于10ml離心管，850rpm下離心3min，沉淀物加5mlb5洗滌培養(yǎng)基，搖勻，850rpm下離心2min，重復(fù)兩次，所得沉淀物即為南瓜游離小孢子；將南瓜游離小孢子轉(zhuǎn)移入南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，33℃熱激處理48h后轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)直至胚性愈傷組織形成。
實施例1
配制本發(fā)明所述的一種南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方具體如下：
kno385mg/l，mgso4?7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2?4h2o180mg/l，mnso4?4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4?7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4?7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4?2h2o0.25mg/l，cuso4?5h2o0.025mg/l，cocl2?6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，l-谷氨酰胺500mg/l，維生素b11.0mg/l，維生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，煙酸5.0mg/l，肌醇170mg/l，甘氨酸4.0mg/l，環(huán)鳥苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基亞硝基脲1.5g/l，蔗糖60g/l，植物凝膠3.25g/l，6-ba0.2mg/l，naa0.35mg/l，甘露醇12g/l，聚乙二醇160mg/l，水解蛋白1.2g/l，植物硫化激動素psk-α30pmol/l，ph5.6。
南瓜游離小孢子的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：
將南瓜種子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧長至3-4米后進入初花期，選擇單核晚期南瓜花蕾進行取材，單核晚期南瓜花蕾的選材標(biāo)準(zhǔn)為：測量花蕾的縱莖和橫莖長度并計算縱橫比，取材縱橫莖之比為2.4-2.6的南瓜花蕾；然后將選材的南瓜花蕾置于4℃冰箱內(nèi)低溫預(yù)處理1-2d，接種前，將花蕾轉(zhuǎn)移入超凈工作臺無菌燒杯中，倒入70%酒精進行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗3次；瀝干水分后，在b5液體洗滌培養(yǎng)基中用平頭玻棒碾壓花蕾，擠出小孢子；懸浮液經(jīng)50μm無菌微孔紗布過濾，收集濾液于10ml離心管，850rpm下離心3min，沉淀物加5mlb5洗滌培養(yǎng)基，搖勻，850rpm下離心2min，重復(fù)兩次，所得沉淀物即為南瓜游離小孢子；將南瓜游離小孢子轉(zhuǎn)移入南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，33℃熱激處理48h后轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)直至胚性愈傷組織形成。
為了比較本發(fā)明所提供的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基各組分的配比效果，我們對本發(fā)明提供的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行了組分改變的單因子試驗，試驗品種亦采用錦紅一號和黃金二號，游離小孢子的分離方法、組培操作方法、培養(yǎng)方法均相同，胚性愈傷組織形成后分別統(tǒng)計錦紅一號和黃金二號的游離小孢子在各培養(yǎng)基內(nèi)的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率。
單因子試驗的試驗組分分別為：agno3、腺嘌呤、環(huán)鳥苷酸、谷胱甘肽、甲基亞硝基脲、植物凝膠、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激動素psk-α，各組分因子梯度濃度設(shè)置和試驗結(jié)果如下表1-9。
由表1到表9的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分改變的單因子試驗可以發(fā)現(xiàn)，采用低含量的植物凝膠，使配制成的培養(yǎng)基半固體化，對南瓜游離小孢子的誘導(dǎo)更有利，而當(dāng)植物凝膠比例繼續(xù)降低時，游離小孢子的誘導(dǎo)率突降為0，這是由于小孢子沉降入培養(yǎng)基內(nèi)造成小孢子誘導(dǎo)生長缺氧造成的；而agno3、甲基亞硝基脲配比的增加產(chǎn)生了很明顯的不利效應(yīng)；而腺嘌呤、環(huán)鳥苷酸、谷胱甘肽、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激動素psk-α的增加不能顯著增加培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果，由于這些添加物的增加會提高培養(yǎng)基的配制成本，在培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果達最優(yōu)值的最小配比量是綜合生產(chǎn)成本后的最佳配比。由此可見，進行任何培養(yǎng)基組分的增加或減少均是不利的，同時說明本發(fā)明的組分配比是最優(yōu)的。
實施例2
為了比較本發(fā)明所提供的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基與其它培養(yǎng)基對南瓜游離小孢子胚性愈傷組織誘導(dǎo)效率的差異，我們另外選擇了2種游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，試驗品種亦采用錦紅一號和黃金二號，游離小孢子的分離方法、組培操作方法、培養(yǎng)方法均與實施例1相同，胚性愈傷組織形成后分別統(tǒng)計錦紅一號和黃金二號的小孢子在該2種培養(yǎng)基內(nèi)的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率。
其它2種游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：
nln培養(yǎng)液，ph為5.8（對比文件來自于栗根義等《大白菜游離小孢子培養(yǎng)》）；
nln-13培養(yǎng)基+0.5g/l活性炭，ph為5.8（對比文件來自于蔣武生等《活性炭對小白菜小孢子培養(yǎng)的影響》）。
培養(yǎng)基對比實驗
將采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基誘導(dǎo)常州長白梗和合肥小葉菜游離小孢子統(tǒng)計所得的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率與對比實施例的錦紅一號和黃金二號小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率進行比較，比較結(jié)果如下表10所示。
由表10可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基對南瓜品種錦紅一號和黃金二號的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率平均值達到了16.7個/蕾，而前人所采用的兩種培養(yǎng)基對南瓜品種錦紅一號和黃金二號的小孢子愈傷組織誘導(dǎo)率平均值分別僅為4.3個/蕾和8.9個/蕾，可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所提供的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基對南瓜游離小孢子的誘導(dǎo)能力做出了顯著的提升。
本發(fā)明所提供的南瓜游離小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是在現(xiàn)有其它蔬菜種的研究基礎(chǔ)之上創(chuàng)造性改良的成果，是經(jīng)過大量單因子、多因子試驗所篩選的最優(yōu)組合，我們進行了大量的實驗研究亦得出本發(fā)明的組分配比是最優(yōu)的。采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基可以大大提高游離南瓜小孢子胚性愈傷的誘導(dǎo)效率，因此具有較高的產(chǎn)業(yè)推廣價值。
以上實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明保護范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。