背景技術(shù)：

1、將擬胚體(embryoid?body)包埋在水凝膠中以培養(yǎng)腦類器官的方法很難自動化。類器官必須與培養(yǎng)基一起運(yùn)輸，但過多的培養(yǎng)基可能會使用于包封擬胚體和類器官的水凝膠(例如matrigel)液化。

2、lancaster和knoblich(nat?protoc.2014october；9(10):2329-2340)描述了由人多能干細(xì)胞(hpsc)生成腦類器官的方法。描述了一種將適當(dāng)分化的擬胚體(eb)轉(zhuǎn)移到matrigel液滴的勞動密集型過程，該過程需要手動制備凹坑石蠟?zāi)せ|(zhì)以產(chǎn)生matrigel液滴。需要精細(xì)而快速地處理eb，以避免損壞聚集體或避免matrigel的過早聚合。

3、需要改進(jìn)的將擬胚體包埋在水凝膠中以培養(yǎng)腦類器官的自動化方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、提供了將擬胚體(eb)包埋在水凝膠、培養(yǎng)腦類器官的自動化方法、以及自動篩選腦類器官的方法。

2、提供了一種用于培養(yǎng)腦類器官的方法，包括將擬胚體包埋在液體水凝膠中以包封擬胚體。使用分離孔微孔板可以精細(xì)、高效、自動地將擬胚體包埋在水凝膠中。該方法可以包括固化包封擬胚體的水凝膠，并將包封擬胚體的固化水凝膠懸浮在分離孔微孔板內(nèi)的培養(yǎng)基中。提供了用于使包封擬胚體的液體水凝膠成形為更接近球形、使包封eb的水凝膠固化并將水凝膠包埋的eb懸浮在培養(yǎng)基中的方法。提供了將水凝膠包埋的eb運(yùn)輸?shù)缴锓磻?yīng)器中、飼養(yǎng)eb并使其分化為腦類器官以及測試腦類器官的方法。

3、提供了一種用于培養(yǎng)類器官的方法，該方法包括將擬胚體添加至第一培養(yǎng)基中，所述第一培養(yǎng)基位于分離孔微孔板的主孔內(nèi)中，該分離孔微孔板包括多個孔單元，每個孔單元包括主孔、副孔以及將主孔連接至副孔的一個或多個微通道；通過副孔將第一培養(yǎng)基從孔單元中移除；添加液體水凝膠以包封擬胚體；在第一時間段內(nèi)孵育所述板以固化包封有擬胚體的水凝膠；以及向副孔中添加第二培養(yǎng)基，以使包封有擬胚體的固化水凝膠與板分離，并懸浮在第二培養(yǎng)基中。

4、在一些例子中，將擬胚體添加到主孔內(nèi)的第一培養(yǎng)基中包括自動移液。

5、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括在移除第一培養(yǎng)基之前傾斜分離孔微孔板，以將擬胚體移至主孔的拐角，任選地，其中所述傾斜包括自動傾斜分離孔微孔板。

6、分離孔微孔板的傾斜可以包括將擬胚體移向微通道，任選地，其中所述傾斜包括將板傾斜到與水平位置成1至60度、5至45度、5至35度、5至25度、5至15度、7至12度或約10度的角度。

7、分離孔微孔板的傾斜可以包括將擬胚體移離微通道，任選地，其中所述傾斜包括將板傾斜到與水平位置成1至60度、5至15度、7至12度或約10度的角度。

8、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括在移除第二培養(yǎng)基之前，將微孔板恢復(fù)到水平位置。

9、在一些例子中，添加液體水凝膠以包封擬胚體包括對液體水凝膠進(jìn)行經(jīng)圖像引導(dǎo)的移液，任選地，其中所述經(jīng)圖像引導(dǎo)的移液是經(jīng)自動圖像引導(dǎo)的移液，包括將液體水凝膠輸送到擬胚體的至少一部分的頂部。

10、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括在添加液體水凝膠之前冷卻微孔板，任選地，其中所述冷卻是自動冷卻至低于室溫的溫度，或冷卻至4至8攝氏度的溫度范圍內(nèi)。

11、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括在添加液體水凝膠之前將微孔板加熱至孵育溫度，任選地，其中所述加熱是自動加熱。

12、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法包括在添加第二培養(yǎng)基之后進(jìn)一步傾斜微孔板，以使包封擬胚體的固化水凝膠移離微通道，任選地，其中所述進(jìn)一步傾斜包括自動的進(jìn)一步傾斜。

13、在一些例子中，在第一時間段內(nèi)進(jìn)行孵育以固化水凝膠，該時間段選自由約5分鐘至約90分鐘、約10分鐘至約60分鐘、約20分鐘至約40分鐘和約30分鐘組成的組中，任選地，其中在孵育步驟之前，將微孔板在室溫下保持第二時間段。

14、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括通過副孔定期地更換孔單元中的第二培養(yǎng)基，以飼養(yǎng)擬胚體。

15、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括在添加液體水凝膠以包封擬胚體之后和孵育之前，將生物相容性油引入主孔中，任選地，其中所述引入包括將生物相容性油自動移液到主孔中。

16、在一些例子中，所述引入包括將移液器吸頭定位在水凝膠內(nèi)，并將包封有擬胚體的水凝膠和油抽吸到移液器吸頭中，任選地，其中所述定位是經(jīng)圖像引導(dǎo)的定位。可以在至少0.3秒、至少0.5秒、至少0.7秒或至少1秒的時間段內(nèi)緩慢地進(jìn)行所述抽吸。

17、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括將油和包封有擬胚體的水凝膠從移液器吸頭推壓回主孔中?？梢栽谥辽?.3秒、至少0.5秒、至少0.7秒或至少1秒的時間段內(nèi)緩慢地進(jìn)行所述推壓。

18、在一些例子中，將生物相容性油引入主孔會使包封擬胚體的水凝膠變得更接近球形。

19、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括在固化包封有擬胚體的水凝膠之后，通過副孔從主孔中抽出生物相容性油；和

20、在添加第二培養(yǎng)基之前，用洗滌培養(yǎng)基洗滌孔單元，任選地，其中所述洗滌培養(yǎng)基處于室溫。

21、在一些例子中，培養(yǎng)類器官的方法還包括將包埋在固化水凝膠中的包封的擬胚體轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中進(jìn)行成熟。

22、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括將包封有擬胚體的水凝膠和生物相容性油轉(zhuǎn)移到油池中，該油池被加熱至孵育溫度以固化包封有類擬胚體的水凝膠。

23、在一些例子中，油池包括將包封有擬胚體的水凝膠轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器的分流，該生物反應(yīng)器任選地包括過濾器。

24、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括從生物反應(yīng)器中排空油，其中所述過濾器保留了包封有擬胚體的固化水凝膠；洗滌生物反應(yīng)器并保留包封有擬胚體的固化水凝膠；以及向生物反應(yīng)器中添加第三培養(yǎng)基，以飼養(yǎng)洗滌過的水凝膠包封的擬胚體。

25、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法還包括，其中將包封有擬胚體的水凝膠轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器的油池分流與第三培養(yǎng)基相遇；并且該方法還包括使油和第三培養(yǎng)基的混合物分層；以及通過過濾系統(tǒng)移除油層以將包封有擬胚體的固化水凝膠保持在第三培養(yǎng)基中；以及將第三培養(yǎng)基中包封有擬胚體的固化水凝膠引導(dǎo)至生物反應(yīng)器。

26、在一些例子中，用于培養(yǎng)類器官的方法是自動化方法，其中將擬胚體添加到第一培養(yǎng)基中、從孔單元中移除第一培養(yǎng)基、添加液體水凝膠和添加第二培養(yǎng)基各自包括自動移液。

27、類器官可以是腦類器官。類器官可以是肝類器官。

28、在一些例子中，擬胚體是表現(xiàn)出胚層分化的分化擬胚體。

29、在一些例子中，類器官是腦類器官。腦類器官可以是大腦類器官。

30、在一些例子中，水凝膠為細(xì)胞外基質(zhì)。例如，水凝膠可選自由小鼠engelbreth-holm-swarm(ehs)肉瘤基質(zhì)、i型膠原、纖維蛋白、透明質(zhì)酸(ha)、甲基丙烯酸明膠(gelma)、脫細(xì)胞基質(zhì)、海藻酸鹽、蠶絲、納米纖維素、聚乙二醇(peg)、自組裝肽、聚乳酸/(共)乙醇酸、聚己內(nèi)酯、聚丙烯酰胺、低聚(乙二醇)取代的聚異氰肽和elp(彈性蛋白樣蛋白)組成的組中。

31、在一些例子中，液體水凝膠是冷液體水凝膠，任選地在低于約10℃的溫度下、或在4至8℃的溫度范圍內(nèi)。在一些例子中，生物相容性油的密度不同于水。生物相容性油的密度可以高于水。密度高于水的生物相容性油可以是鹵代烴，任選地是全氟化烴。在一些例子中，生物相容性油的密度小于水。密度小于水的生物相容性油可以是硅油、礦物油或植物油。

32、提供了一種用于培養(yǎng)腦類器官的自動化方法，包括將分化的擬胚體添加到位于分離孔微孔板的主孔內(nèi)的第一培養(yǎng)基中，該分離孔微孔板包括多個孔單元，每個孔單元包括主孔、副孔以及將主孔連接到副孔的一個或多個微通道；傾斜分離孔微孔板，將擬胚體移至主孔的拐角；通過副孔從孔單元中移除第一培養(yǎng)基；冷卻微孔板并添加液體水凝膠，將擬胚體包封在傾斜微孔板的主孔的拐角；在第一時間段內(nèi)孵育所述板以固化包封有擬胚體的水凝膠；以及向副孔中添加第二培養(yǎng)基，以使包封有擬胚體的固化水凝膠與所述板分離，并懸浮在第二培養(yǎng)基中。