本發(fā)明涉及高通量測序建庫，特別涉及一種dap-seq測序建庫方法。

背景技術(shù)：

1、轉(zhuǎn)錄因子(transcription?factor，tf)在基因表達調(diào)控中扮演著核心角色，通過特異性結(jié)合到基因組上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(transcriptionfactor?binding?sites，tfbs)來調(diào)控下游基因的表達。探究tfbs對于理解tf的功能具有重要意義。染色質(zhì)免疫沉淀測序(chip-seq)是一種揭示tfbs的有效手段。然而，chip-seq的成功在很大程度上依賴于抗體的質(zhì)量。對于稀有或表達水平較低的蛋白質(zhì)，制備高質(zhì)量的抗體具有一定難度。此外，對于非模式生物，可用的商業(yè)化抗體資源極其有限。這些因素限制了chip-seq技術(shù)在非模式生物或不太常見的轉(zhuǎn)錄因子中的廣泛應(yīng)用。

2、dna親和純化測序(dnaaffinitypurification?sequencing，dap-seq)克服了chip-seq在抗體獲取和物種方面的限制，允許研究者在體外條件下，利用經(jīng)過特殊改造的轉(zhuǎn)錄因子蛋白直接與基因組dna片段相互作用，對富集的dna片段進行高通量測序，以識別tfbs。dap-seq技術(shù)因其不依賴抗體和物種的優(yōu)勢，自推出后，已被廣泛應(yīng)用于多個學(xué)科，有效助力了轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的深入解析。

3、盡管dap-seq技術(shù)在tfbs的研究中提供了一種有效的策略，但在實際的質(zhì)粒構(gòu)建階段，研究人員仍面臨著難題。在質(zhì)粒的構(gòu)建初期，有時需要確定合適的限制性內(nèi)切酶對載體和外源dna進行切割，設(shè)計合適的改造轉(zhuǎn)錄因子蛋白和相應(yīng)的dna結(jié)合序列可能較為復(fù)雜。在質(zhì)粒構(gòu)建過程中，效率也不如預(yù)期，需要多次的構(gòu)建才能成功，并且質(zhì)粒的提取、純化、驗證過程往往耗時較長，甚至有假陽性克隆的可能，這些情況無形中增加了研究者實驗與時間的成本。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種dap-seq測序建庫方法，對傳統(tǒng)的dna親和純化測序(dap-seq)實驗流程進行優(yōu)化，提高了質(zhì)粒構(gòu)建的效率，減少所需的時間和資源消耗。

2、本發(fā)明提供了一種dap-seq測序建庫方法，包括：

3、s1、設(shè)計基因特異性引物，以使所述引物能夠精準(zhǔn)識別并結(jié)合到目標(biāo)基因序列上，通過pcr擴增基因片段并進行純化，以確保獲得高純度的目標(biāo)dna作為體外蛋白翻譯的基因模板；

4、s2、在體外蛋白表達階段，利用特定的表達系統(tǒng)，投入模板合成目標(biāo)蛋白質(zhì)；

5、s3、所述蛋白質(zhì)在dna片段的篩選過程中，與特定dna結(jié)合，利用蛋白質(zhì)與dna之間的相互作用，通過親和純化技術(shù)篩選出dna片段；

6、s4、dna片段被構(gòu)建成文庫上機測序。

7、進一步地，所述步驟s1具體包括：

8、s11、將3xflag標(biāo)簽連接于目標(biāo)蛋白c端或n端，其中：

9、c端：上游引物f包括保護堿基、sp6啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點、kozak序列、翻譯起始密碼子、目的蛋白cds區(qū)起始位置17-22bp序列；下游引物r包括翻譯終止密碼子反向互補序列、3xflag反向互補序列、目的蛋白cds終止密碼子之前序列的反向互補序列；

10、n端：上游引物f包括保護堿基、sp6啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點、kozak序列、翻譯起始密碼子、3xflag序列、目的蛋白cds區(qū)起始密碼子atg之后的序列；下游引物r包括翻譯終止密碼子反向互補序列和目的蛋白cds區(qū)終止密碼子之前序列的反向互補序列；

11、s12、引物測試與比對：利用pcr擴增目的片段后，使用一代sanger測序獲得序列信息并比對確認；

12、s13、擴增與純化：根據(jù)引物擴增得到pcr產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒回收純化pcr產(chǎn)物。

13、進一步地，所述步驟s2具體包括：

14、將解凍后的30μl體外表達蛋白試劑盒中的master?mix與5～8μl?pcr產(chǎn)物配置反應(yīng)混合液，并用ddh2o將體系補至50μl，吸打混勻后于25℃孵育2h。

15、進一步地，所述步驟s3中，dna片段化及片段篩選具體包括：

16、s301、取100pg～1μg樣品dna，加入5μl?feabuffer，并用ddh2o補至40μl，全程于冰上操作；接著加入10μl?fea?enzyme?mix，使用移液器吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底，置于pcr儀中進行反應(yīng)；

17、s302、根據(jù)dna量按稀釋adapter至合適濃度，按照第一預(yù)設(shè)表配置連接反應(yīng)體系；

18、s303、使用移液器吹打混勻，并短暫離心后將pcr管置于pcr儀中；

19、s304、將平衡至室溫的80μl?dnaclean?beads加入上述pcr反應(yīng)產(chǎn)物，吸打混勻后于室溫下靜置10min；

20、s305、將pcr管開蓋、置于磁力架上，靜置5min，棄上清；

21、s306、保持pcr管始終置于磁力架上，加200μl新鮮配置80％乙醇，室溫孵育30s后，移除上清，重復(fù)一次后，開蓋空氣干燥磁珠5min；

22、s307、將pcr管從磁力架中取出，加入23μl?h2o，重懸磁珠，室溫靜置2min；

23、s308、將pcr管開蓋置于磁力架上，靜置5min后，小心吸取21μl上清至一個新的pcr管中，加入2μl的dap?f和2μl的dap?r，至總體積25μl，置于pcr儀中，擴增文庫：

24、s309、在產(chǎn)物中加入40μl(0.8x)dnaclean?beads，吸打混勻后室溫放置10min；

25、s310、重復(fù)步驟s305-s307；

26、s311、將pcr管開蓋置于磁力架上，靜置5min后，小心吸取21μl上清至一個新的pcr管中。

27、進一步地，所述第一預(yù)設(shè)表中包括組分和每個組分的體積，具體為：上一步產(chǎn)物50μl、rapid?ligation?buffer?325μl、rapid?dnaligase?5μl、dapadapter?5μl、ddh2o?15μl、total?100μl。

28、進一步地，所述步驟s3中，蛋白親和吸附dna片段具體包括：

29、s3001、轉(zhuǎn)移20μl已平衡至室溫的抗體磁珠至ep管，置磁力架，貼壁1min，溶液澄清后，棄上清；

30、s3002、將ep管從磁力架上取出，加入20μl?dapbuffer，重懸磁珠，洗滌干凈后，置磁力架，貼壁1min，溶液澄清后，棄上清；

31、s3003、加入40μl?dap?buffer，重懸磁珠，加40μl蛋白體外表達混合液，重懸磁珠，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，25℃孵育1h；

32、s3004、將剩余10μl轉(zhuǎn)移至新ep管，標(biāo)記為input-protein；

33、s3005、完成孵育后，閃甩，使液體和磁珠均位于管底，置于磁力架上，貼壁1min，上清標(biāo)記為supernatant，保存于-20℃；

34、s3006、加入85μl?dapbuffer重懸磁珠，磁珠自然沉降后，置于磁力架上，貼壁1min，棄上清；

35、s3007、加入40μl?dapbuffer重懸磁珠，加入30～100ng?input?dna，補ddh2o至80μl，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，4℃孵育過夜；

36、s3008、將ep管從旋轉(zhuǎn)混合儀取出，閃甩；置于磁力架上，貼壁1min，棄上清；

37、s3009、將ep管從磁力架上取出，加入85μl冰預(yù)冷的dapbuffer，重懸磁珠，洗滌干凈后轉(zhuǎn)移至1個新的ep管，加入17μl磁珠標(biāo)記為dap-protein，剩余磁珠標(biāo)記為dap-dna；

38、s3010、向s3004中input-protein管加入20μl?2x?sds?loading?buffer，從s3005中supernatant中分離20μl至新ep管，加入20μl?2x?sds?loading?buffer，將s3009中dap-protein管置于磁力架，靜置5min棄上清，加入25μl?1x?sds?loadingbuffer；

39、s3011、將上述3管煮沸10min后置磁力架，靜置5min后，將上清轉(zhuǎn)移到3個新的ep管中，進行western?blot質(zhì)檢；

40、s3012、將dap-dna管置于磁力架上，靜置5min，棄上清后加入200μl?elutionbuffer，重懸磁珠；input-dna樣品用elutionbuffer補足到200μl；

41、s3013、向上述每管中分別加入5μg?rnasea，thermo?mixer上37℃震蕩30min；

42、s3014、閃甩，每管分別加入200μg?proteinase?k，纏上封口膜，65℃震蕩2h；

43、s3015、將ep管置磁力架，靜置5min，將上清轉(zhuǎn)移到新的ep管中；

44、s3016、每管中加入200μl酚氯仿異戊醇(ph8.0)劇烈震蕩30s，室溫、12000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移200μl上清到新的ep管中；

45、s3017、每管中加入20μl?3m?naac(ph5.2)，1μl?glycogen，混勻，再加入600μl無水乙醇，劇烈倒置混勻，于-80℃沉淀1h；

46、s3018、沉淀結(jié)束后，4℃、12000rpm離心15min，棄掉乙醇；

47、s3019、加入1ml冰預(yù)冷的75％乙醇，緩慢倒置數(shù)次洗滌，4℃、12000rpm離心5min，棄乙醇；重復(fù)一次；

48、s3020、閃甩，徹底吸凈剩余乙醇，56℃干燥3min后，input加入50μl?h2o回溶，dap加入30μl?h2o回溶。

49、進一步地，所述步驟s4具體包括：

50、s41、按照第二預(yù)設(shè)表配制擴增反應(yīng)混合液，加入到0.2mlpcr管中；

51、s42、將樣品置于pcr儀中，擴增文庫；

52、s43、將pcr產(chǎn)物補水至100μl，混勻后加入70μl(0.7x)dnaclean?beads，吹打混勻，室溫放置10min；

53、s44、將pcr管開蓋、置于磁力架上，靜置5min后轉(zhuǎn)移上清至新的pcr管中，加入20μl(0.2x)dnaclean?beads，吹打混勻，室溫放置10min，開蓋再靜置5min；

54、s45、保持pcr管始終置于磁力架上，加入200μl新鮮配置80％乙醇，室溫孵育30s后，移除上清；該步驟重復(fù)操作一次；開蓋空氣干燥磁珠5min；

55、s46、將pcr管從磁力架中取出，加入27μl?h2o，重懸磁珠，室溫靜置2min；

56、s47、將pcr管開蓋置于磁力架上，靜置5min后，吸取25μl上清至一個新的pcr管中；

57、s48使用qubit試劑對文庫進行定量，用bioanalyzer進行片段分析。

58、進一步地，所述第二預(yù)設(shè)表中包括組分和每個組分的體積，具體為：input?or?dapdnaxμl、2x?kapahifi?hotstart?readymix?25μl、bgi?f引物(10μm)2.5μl、bgi?rx引物(10μm)2.5μl、ddh2o補至總體積50μl。

59、本發(fā)明的有益效果為：

60、1、減少克隆過程中的錯誤：傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建方法涉及到多個步驟，如限制性酶切、連接、轉(zhuǎn)化等，每個步驟都可能引入錯誤或變異。而新方法通過直接表達pcr產(chǎn)物，減少了這些步驟，從而降低了因克隆過程中錯誤而導(dǎo)致的實驗誤差。

61、2、提高實驗效率：由于省去了質(zhì)粒構(gòu)建和驗證的時間，本發(fā)明可以更快地獲得實驗數(shù)據(jù)，這對于需要快速得到結(jié)果的研究尤為重要。

62、3、減少假陽性結(jié)果：傳統(tǒng)方法中，質(zhì)粒構(gòu)建的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致假陽性克隆的出現(xiàn)。本發(fā)明通過直接表達，減少了這種可能性，提高了結(jié)果的可靠性。

63、4、簡化操作流程：簡化的實驗流程減少了人為操作錯誤的可能性，從而提高了實驗的重復(fù)性和一致性。

64、5、成本效益：由于省去了質(zhì)粒構(gòu)建和驗證的成本，本發(fā)明在經(jīng)濟上更為高效，使得更多的研究者能夠進行dap-seq實驗。

65、6、靈活性：本發(fā)明允許快速更換不同的dna片段進行測試，這為研究者提供了更大的靈活性，可以更廣泛地探索不同的tf和dna結(jié)合位點。