本發明涉及農業害蟲防治，尤其涉及草地貪夜蛾幾丁質酶2基因dsrna及其納米制劑的制備與應用。

背景技術：

1、草地貪夜蛾（ spodoptera?frugiperda）是危害糧食生產的重要入侵害蟲，是聯合國糧農組織全球預警的重大遷飛性害蟲。其食性雜，寄主多（350多種），可危害玉米、甘蔗、水稻、花生和辣椒等80多種經濟作物。幼蟲啃食作物的葉片、莖稈、甚至穗，也可以“切”根的形式危害幼苗造成苗期作物的死亡，導致嚴重的經濟損失。

2、目前草地貪夜蛾的防治仍以化學農藥為主，同時結合物理誘殺、生物防治等手段。但隨著化學農藥的大量施用，其抗藥性日趨增強。同時農藥大量使用造成的食品安全和生態安全等問題日益凸顯。因此，開發綠色低毒的新型農藥，實現農藥減量增效是實現草地貪夜蛾有效防控，實現農業可持續發展的重大需求。

3、rna農藥是基于rna干擾（rna?interference，rnai）技術創制的新型農藥，通過抑制有害生物重要功能基因的表達，造成其發育停滯或死亡，進而達到病蟲害防控的目的，具有防治目標專一、靶標開發便捷、應用方便、綠色無污染、無殘留及環境兼容性強等眾多優勢，符合公眾對綠色農藥的需求。

4、rna干擾是由雙鏈rna（double-stranded?rna，dsrna）誘發的、同源mrna高效特異性降解的現象，利用rnai技術開發的rna農藥具有防治靶標范圍廣、應用方便、易于操作、綠色無污染、無殘留及環境兼容性強等眾多優勢。但rnai技術在實際應用中依然存在一些挑戰，制約了其大規模推廣。dsrna制備需要復雜的工藝流程和高昂的費用；dsrna在環境中的穩定性差，易被核酸酶降解，影響其殺蟲效果和持續性；另外，現有的dsrna遞送方法（如噴灑和飼喂）難以確保其有效進入害蟲體內并發揮作用。因此降低dsrna的生產成本、提高其環境穩定性及優化遞送方式是rna農藥領域亟待解決的問題。

5、納米材料殼聚糖、脂質體和星狀陽離子聚合物（spc）等不僅能對dsrna起到保護作用，還能大大提高dsrna導入效率。如使用殼聚糖搭載ecr?dsrna飼喂煙粉虱，其死亡率較單獨飼喂ecr?dsrna提高至80%。

6、在此背景下，如何提供一種能夠利用rnai技術高效防治草地貪夜蛾的dsrna分子以及納米殺蟲劑，成為本領域亟需解決的技術難題。

技術實現思路

1、第一方面，本發明提供了一種草地貪夜蛾幾丁質酶2基因，其核苷酸序列如seq?idno.1所示。

2、經過對草地貪夜蛾不同靶基因的大量篩選，本發明發現針對草地貪夜蛾幾丁質酶2基因設計的dsrna分子能夠高效沉默基因表達，經實驗驗證，采用seq?id?no.1所示基因序列經體外轉錄合成的dsrna能導致草地貪夜蛾蛻皮異?；蚧籍惓６劳?，對草地貪夜蛾具有較高的致死率，能夠有效防治草地貪夜蛾，解決了傳統化學殺蟲劑帶來的環境和健康問題。

3、第二方面，本發明提供了一種dsrna，其由所述的草地貪夜蛾幾丁質酶2基因轉錄獲得。

4、第三方面，本發明提供了所述dsrna的合成方法，包括：提取草地貪夜蛾的總rna，反轉錄獲得cdna作為模板，采用seq?id?no.2和seq?id?no.3所示的引物對進行pcr擴增，將擴增產物純化后作為模板序列合成dsrna。

5、第四方面，本發明提供了引物對，所述引物對為seq?id?no.2和seq?id?no.3所示，所述引物對用于擴增獲得所述草地貪夜蛾幾丁質酶2基因。

6、第五方面，本發明提供了一種殺蟲劑，其中含有所述的dsrna。

7、在一些實施方案中，所述殺蟲劑為納米制劑。

8、在一些實施方案中，所述殺蟲劑中包括所述的dsrna以及納米載體。

9、在一些實施方案中，所述納米載體為殼聚糖。

10、在一些實施方案中，所述殺蟲劑為殼聚糖/dsrna納米制劑。

11、第六方面，本發明提供了所述殺蟲劑的制備方法，包括：將殼聚糖、乙酸和乙酸鈉混合制備成殼聚糖溶液；然后將所述殼聚糖溶液與dsrna溶液混合，經靜置、溫育、渦旋、再靜置以及離心沉淀制得。

12、采用上述方法制備的殼聚糖/dsrna納米制劑殺蟲劑，對dsrna保護效果好、滲透效率高、操作簡便，可特異性沉默基因表達，基因沉默效率達87.13%，最終導致草地貪夜蛾蛻皮異?；蚧籍惓６劳?，異常率達80%，化蛹前死亡率達75%。

13、在一些實施方案中，所述殼聚糖溶液的濃度為0.05%~0.5%（w/v），更優選為0.05%~0.2%。

14、在一些實施方案中，所述dsrna溶液的濃度為500~2000ng/μl，更優選為800~1200ng/μl。

15、在一些實施方案中，所述殼聚糖溶液與dsrna溶液按照體積比（0.5~2）：1混合。

16、優選地，所述殼聚糖溶液與dsrna溶液按照體積比1：（0.8~1.2）混合。

17、在一些實施方案中，所述靜置的時間為2min以上。

18、在一些實施方案中，所述溫育的溫度為50~60℃，優選為52~58℃。

19、在一些實施方案中，所述溫育的時間為1min以上。

20、在一些實施方案中，所述渦旋的時間為10s~50s，更優選為25s~35s。

21、在一些實施方案中，所述再靜置為在室溫下靜置1h以上。

22、在一些實施方案中，所述離心的溫度為2~6℃，轉速為12000rpm以上。

23、在一些實施方案中，所述離心的時間為10min以上。

24、在一些實施方案中，所述殺蟲劑的制劑類型為納米制劑、粉劑、顆粒劑、水乳劑、氣霧劑或乳油劑。

25、第七方面，本發明提供了所述的草地貪夜蛾幾丁質酶2基因、所述的dsrna或所述的殺蟲劑在以下至少一方面中的應用：（1）致死農業害蟲；（2）農業害蟲管理；（3）農業害蟲防治。

26、在一些實施方案中，所述農業害蟲為鱗翅目害蟲，優選為草地貪夜蛾。

27、與現有技術相比，本發明的有益效果至少在于：

28、本發明提供了一種能夠利用rnai技術高效防治草地貪夜蛾的dsrna分子，對靶標基因具有高特異性、高基因沉默效率，用其制備的殺蟲劑能導致草地貪夜蛾蛻皮異?；蚧籍惓６劳觯瑢Σ莸刎澮苟昃哂休^高的致死率，殺蟲效果快，操作簡便，能夠有效防治草地貪夜蛾，解決了傳統化學殺蟲劑帶來的環境和健康問題，具有廣闊的市場應用前景。

技術特征：

1.草地貪夜蛾幾丁質酶2基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

2.一種dsrna，其特征在于，其由權利要求1所述的草地貪夜蛾幾丁質酶2基因轉錄獲得。

3.權利要求2所述dsrna的合成方法，其特征在于，包括：提取草地貪夜蛾的總rna，反轉錄獲得cdna作為模板，采用seq?id?no.2和seq?id?no.3所示的引物對進行pcr擴增，將擴增產物純化后作為模板序列合成dsrna。

4.引物對，其特征在于，所述引物對為seq?id?no.2和seq?id?no.3所示。

5.一種殺蟲劑，其特征在于，其中含有權利要求2所述的dsrna。

6.根據權利要求5所述的殺蟲劑，其特征在于，所述殺蟲劑為納米制劑；所述殺蟲劑中包括權利要求2所述的dsrna以及納米載體。

7.根據權利要求6所述的殺蟲劑，其特征在于，所述納米載體為殼聚糖。

8.權利要求7所述殺蟲劑的制備方法，其特征在于，包括：將殼聚糖、乙酸和乙酸鈉混合制備成殼聚糖溶液；然后將所述殼聚糖溶液與dsrna溶液混合，經靜置、溫育、渦旋、再靜置以及離心沉淀制得。

9.根據權利要求5所述的殺蟲劑，其特征在于，所述殺蟲劑的制劑類型為納米制劑、粉劑、顆粒劑、水乳劑、氣霧劑或乳油劑。

10.權利要求1所述的草地貪夜蛾幾丁質酶2基因、權利要求2所述的dsrna或權利要求5~9中任一項所述的殺蟲劑在以下至少一方面中的應用：

技術總結
本發明涉及農業害蟲防治技術領域，尤其涉及草地貪夜蛾幾丁質酶2基因dsRNA及其納米制劑的制備與應用。本發明提供了一種能夠利用RNAi技術高效防治草地貪夜蛾的dsRNA分子，對靶標基因具有高特異性、高基因沉默效率，用其制備的殺蟲劑能導致草地貪夜蛾蛻皮異常或化蛹異常而死亡，對草地貪夜蛾具有較高的致死率，殺蟲效果快，操作簡便，能夠有效防治草地貪夜蛾，解決了傳統化學殺蟲劑帶來的環境和健康問題，具有廣闊的市場應用前景。

技術研發人員：李丹丹,趙許惠,李忠蔚,闞云超,劉潤強,徐莉,邱礽,宋奕霖
受保護的技術使用者：南陽師范學院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24