本發明屬于基因工程，涉及一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法、基因編輯載體及基因編輯轉化體。

背景技術：

1、丹參(salvia?miltiorrhiza?bunge)是一種眾所周知且珍貴的傳統中藥，已被證明在治療心血管疾病方面有效，這種植物也被開發成各種制劑，如著名的復方丹參滴丸，現在在許多國家廣泛使用。丹參中主要含有兩類生物活性化合物，即丹參酮和酚酸。作為二萜類化合物的一種，丹參酮主要包括隱丹參酮(cpt)、丹參酮iia(tan?iia)、二氫丹參酮(dht)和丹參酮i(tani)，它們源自普遍的五碳前體異戊烯焦磷酸(ipp)及其異構體二甲基丙烯焦磷酸(dmapp)，這兩種物質在兩個獨立的途徑中合成，一個是位于葉綠體的2-c-甲基-赤蘚醇4-磷酸(mep)途徑，另一個是位于細胞質的甲戊二酸(mva)途徑。在細胞質中，ipp和dmapp由gpps和fpps依次順序催化產生fpp，fpp再進一步生成甾醇、倍半萜和其他三萜化合物等；丹參中的gpps合成酶在萜類化合物的合成中扮演著重要角色。在質體中，ipp和dmapp在gpps的催化作用下生成gpp，gpp進一步合成單萜和某些二萜化合物等。通過對smgpps及其調控機制的研究，可以為提高丹參酮產量和選育高產丹參品種提供理論依據和技術支持。

2、由于市場需求旺盛，但生物合成丹參酮面臨重重挑戰，加之丹參資源稀缺，使得天然野生丹參中的丹參酮含量并不高。所以，迫切需要開發一種高含量丹參酮的丹參植株，這將是培育高產量、高品質丹參品種的重要嘗試。

技術實現思路

1、本發明要解決的技術問題是克服現有植物基因工程技術的不足，同時為深入研究丹參中植物次生代謝物合成以及調控。本發明提供一種通過基因靶向敲除丹參gpps基因來提高丹參植株中丹參酮含量的方法。

2、本發明采用如下的技術方案：

3、一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法，抑制或破壞丹參中gpps基因的表達。

4、丹參植株中丹參酮合成是一個錯綜復雜的多步驟過程，多個代謝途徑共享相同的前體物質，代謝中間體參與多個終產物的合成，并且部分功能未知，這導致目標代謝產物丹參酮的產量受限。本發明通過基因編輯技術，特別是敲除競爭代謝途徑中的關鍵基因smgpps，可以減少資源的分散，發現可以大大提升丹參酮的產量。

5、作為優選，通過crispr/cas9技術敲除所述丹參gpps基因核心序列的全部或部分序列。

6、作為優選，所述crispr/cas9技術敲除丹參gpps基因的靶點位于丹參gpps基因起始密碼子下游1-300bp區域之內，所述靶點所在區域核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

7、作為優選，所述crispr/cas9技術敲除丹參gpps基因的靶點為：5’-tgtgtaaaagatgttcacgg-3’(seq?id?no.2所示)和5’-tgaagatccacgaatccatg-3’(seq?idno.3所示)。

8、作為優選，首先對丹參gpps基因外顯子序列進行分析，在起始密碼子至下游300bp區域附近通過crispr-p?v2.0網頁(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)設計2個sgrna，構建了包含這兩個sgrna的靶標序列的crispr/cas9基因編輯載體。然后通過農桿菌將載體導入待編輯丹參葉片，誘導分化再生成植株。篩選得到cas9陽性的植株，通過對靶點附近基因組進行克隆測序，進一步得到純合編輯植株。

9、通過上述方法敲除丹參gpps基因核心序列的后，丹參植株生長表型無明顯變化，通過液相色譜-高通量三重四極桿質譜(tq-absolute)測量發現隱丹參酮(cpt)、丹參酮iia(tan?iia)含量顯著提高。

10、作為優選，構建crispr/cas9基因編輯載體的出發載體為pcambia-1300。

11、作為優選，具體包括如下步驟：

12、s1.培養丹參無菌苗；

13、s2.設計兩個與目標基因互補的sgrna分子，以指導cas9蛋白靶定到達特定的基因位點；

14、s3.將sgrna的靶標序列和cas9蛋白的表達載體構建成基因編輯載體，用于植物細胞的遺傳轉化；

15、s4.利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將構建好的基因編輯載體導入植物細胞，產生轉基因丹參植株；

16、s5.在t0代植株苗期提取基因組dna，通過pcr方法進行陽性檢測，篩選出成功轉化的植株；

17、s6.使用高保真dna聚合酶對目標基因組區域進行pcr擴增，這個區域應該包含編輯區域的基因片段，并且長度適中；pcr產物需要通過純化步驟來回收和純化目標dna片段，確保目標dna片段大小正確且條帶單一；純化后的目標dna片段進行sanger測序，測定核酸酶切割的效率。通過測序結果，可以確定是否存在編輯，以及編輯的類型；

18、s7.對編輯陽性丹參植株進行培養6個月以上，取丹參根進行丹參酮(丹參酮iia、隱丹參酮、二氫丹參酮和丹參酮i)含量測定。

19、通過實施上述技術方案，本發明具有如下的優勢：

20、本發明利用基因編輯技術對丹參gpps基因進行敲除以獲得的編輯丹參植株表型與野生型無明顯差異，但丹參酮含量有明顯的提高，從而實現目的基因的功能進一步驗證和生產代謝產物的育種應用。。

技術特征：

1.一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法，其特征在在于，抑制或破壞丹參中gpps基因的表達。

2.根據權利要求1所述的一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法，其特征在在于，通過crispr/cas9技術敲除所述丹參gpps基因核心序列的全部或部分序列。

3.根據權利要求2所述的一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法，其特征在在于，所述crispr/cas9技術敲除丹參gpps基因的靶點位于丹參gpps基因起始密碼子下游1-300bp區域之內，所述靶點所在區域核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4.根據權利要求3所述的一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法，其特征在在于，首先對丹參gpps基因外顯子序列進行分析，設計sgrna靶標序列，構建了包含這兩個sgrna的靶標序列的crispr/cas9基因編輯載體，然后將載體導入待編輯丹參葉片，誘導分化再生成植株，對再生成植株進行篩選得到cas9陽性的植株，通過對靶點附近基因組進行克隆測序，進一步得到純合編輯植株。

5.根據權利要求4所述的一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法，其特征在在于，所述crispr/cas9技術敲除丹參gpps基因的靶標序列為：seq?id?no.2所示序列和seq?id?no.3所示序列。

6.根據權利要求4所述的一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法，其特征在在于，構建crispr/cas9基因編輯載體的出發載體為pcambia-1300。

7.根據權利要求4所述的一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法，其特征在在具體包括如下步驟：

8.一種用于提高丹參植株中丹參酮含量的基因編輯載體，其特征在于，所述基因編輯載體包括編碼cas9核酸內切酶和丹參gpps基因的靶標序列。

9.根據權利要求8所述的一種用于提高丹參植株中丹參酮含量的基因編輯載體，其特征在于，所述靶標序列c為：seq?id?no.2所示序列和seq?id?no.3所示序列。。

10.一種用于提高丹參植株中丹參酮含量的基因編輯轉化體，其特征在于，所述基因編輯轉化體包括編碼cas9核酸內切酶和丹參gpps基因的靶標序列的基因編輯轉化體。

技術總結
本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種提高丹參植株中丹參酮含量的方法、基因編輯載體及基因編輯轉化體，通過對丹參GPPS基因外顯子進行序列分析，和基于CRISPR/Cas9系統靶向敲除丹參GPPS基因外顯子可用于減少丹參酮合成通路代謝流分流向單萜和某些除丹參酮之外的二萜化合物等次生代謝產物，正調控丹參酮合成關鍵酶基因的表達，提升丹參植株中丹參酮的生物合成，并且不會對植物生長發育造成危害。本發明的技術方案得到高丹參酮含量的丹參植株材料對于丹參的基因編輯育種和生產珍稀天然次生代謝物質具有重要的意義，為丹參育種改良提供思路。

技術研發人員：唐克軒,邵金,黎凌,鄭漢,王玉亮,孫小芬
受保護的技術使用者：上海交通大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24