本發明屬于生物，尤其涉及一種永生化羊駝腎細胞系及其構建方法和應用。

背景技術：

1、原代細胞比普通的細胞系更真實地反映某類細胞在體內的病理生理狀態，廣泛應用于胚胎發育、組織維持與重塑、腫瘤發生機制等研究領域，但是原代細胞往往只有特定的幾代能夠穩定增長，無法保證持續傳代，不利于體外細胞實驗，永生化細胞能夠使得細胞獲得持續生長增殖能力的特性。

2、細胞永生化是指體外培養的細胞由于自身改變或者受到外界條件的影響，從增殖衰老危機中逃離，從而獲得無限增殖能力的過程。但是細胞發生自發永生化的概率很低，構建永生化細胞系主要采取外源誘導的方法，包括化學物質、輻射誘變、病毒感染、端粒酶激活等。目前極少見關于羊駝腎細胞永生化的相關報道。

3、目前針對羊駝免疫，常規使用的免疫方法主要有蛋白免疫和多肽免疫，沒有專門的羊駝工具細胞來輔助完成細胞免疫。

4、羊駝腎細胞還可以用于病毒研究，通過觀察病毒在羊駝腎細胞中的生長、復制情況，了解病毒的特性，包括病毒的感染周期、增殖速度等，有助于對病毒感染機制的研究。在藥物研發過程中，羊駝腎細胞可以作為體外模型來測試藥物的毒性。新開發的藥物可能會對腎臟細胞產生影響，通過將藥物作用于羊駝腎細胞，觀察細胞的形態、活性、代謝等方面的變化，從而提高藥物研發的安全性和有效性。

5、因此，如果能夠獲得一種永生化的羊駝腎細胞系，將促進羊駝腎細胞在細胞免疫、病毒感染機制、藥物研發過程的研究與應用。

技術實現思路

1、本發明的目的是彌補現有技術的空白，提供一種永生化羊駝腎細胞系及其構建方法和應用。

2、本發明的發明構思如下：應用猿猴空泡病毒40(sv40)感染羊駝腎原代細胞，使其脫離正常衰老死亡過程并獲得持續分裂能力，最終構建成具備培養簡單、可多次傳代、均一性好等優點的永生化羊駝腎細胞。

3、本發明解決技術問題的技術方案具體如下：

4、在本發明的第一方面，提供了一種永生化羊駝腎細胞系，名稱為永生化羊駝腎細胞(alpaca?kidney?cells)bnalpaca?1.0，其保藏編號為：cgmcc?no.46058。

5、在本發明的第二方面，提供了如第一方面所述的永生化羊駝腎細胞系的構建方法。所述的構建方法包括如下步驟：

6、s1：羊駝原代腎細胞提取和培養；

7、s2：用sv40永生化慢病毒感染羊駝原代腎細胞；

8、s3：永生化羊駝腎細胞的抗性篩選；

9、s4：羊駝腎細胞永生化細胞檢測鑒定；

10、s5：獲得永生化羊駝腎細胞系。

11、優選地，所述的步驟s1，羊駝腎原代細胞的提取和培養，包括如下步驟：

12、1)取新鮮健康的羊駝腎臟，剪取部分羊駝腎臟，并剪成小塊；

13、2)將小塊置于含edta溶液的細胞培養皿中，室溫孵育；

14、3)將步驟2)中的組織小塊用胰蛋白酶消化過夜；

15、4)將腎臟小塊剪成更小的塊后，用胰蛋白酶消化；

16、5)制成懸液，過濾，離心，棄上清；

17、6)加入培養基制成單細胞懸液進行細胞培養；

18、7)更換培養基，隨后每3天換液一次；獲得原代細胞。

19、優選地，所述步驟s2中，感染所用的病毒通過如下方法獲得：

20、1)質粒構建：將sv40病毒的大t抗原基因構建到慢病毒載體plvx-ires-g418里，最后進行質粒抽提；

21、2)轉染前將對數生長期293t細胞鋪板；

22、3)轉染當天將慢病毒載體質粒、輔助質粒pspax2質粒以及pmd2g質粒按質量比2：1：1稀釋于opti-mem培養基中，輕輕混勻，將聚乙烯亞胺pei轉染試劑加到稀釋好的質粒中，輕輕混勻，室溫靜置；

23、4)取出hek-293t細胞，將上述體系逐滴加入到培養板中，輕輕晃勻，放入溫箱培養；

24、5)取轉染后慢病毒顆粒上清，離心，過濾，收集病毒上清。

25、優選地，所述的步驟s2中，sv40大t抗原永生化慢病毒感染，包括如下步驟：

26、1)接種羊駝腎原代細胞，進行病毒感染；

27、2)移除原培養基，加入含感染增強劑的完全培養基，再加入適量的慢病毒sv40即大t?antigen進行孵育；所述的感染增強劑為f108，所述的完全培養基是rpmi?1640培養基，為了增強病毒感染，離心細胞，離心后將細胞放入培養箱中；

28、3)感染后去除含病毒溶液，加入完全培養基，繼續培養。

29、優選地，所述的步驟s3，永生化羊駝腎細胞的抗性篩選，包括如下步驟：將細胞擴培后，加入g418抗生素進行抗性篩選，待細胞處于生長對數期，且細胞活率達到95％以上，將細胞凍存。

30、更優選地，所述的步驟s1，羊駝腎原代細胞的提取和培養，包括如下步驟：

31、1)取新鮮健康的羊駝腎臟，剪取部分羊駝腎臟，并剪成0.5-1平方厘米小塊；

32、2)將小塊置于含edta溶液的細胞培養皿中，室溫孵育5分鐘；

33、3)將步驟2)中的組織小塊在4℃下用胰蛋白酶消化過夜；

34、4)將腎臟小塊剪成更小的塊后，在37℃下用胰蛋白酶消化60分鐘；

35、5)制成懸液，過70目細胞濾網后300g，離心5分鐘，棄上清；

36、6)加入含20％fbs及1％p/s的rpmi?1640培養基制成單細胞懸液，接種于細胞培養皿中，放入37℃，5％co2恒溫細胞培養箱；

37、7)72h后更換培養基，隨后每3天換液一次；獲得原代細胞。

38、更優選地，所述步驟s2中，感染所用的病毒通過如下方法獲得：

39、1)質粒構建：將sv40病毒的大t抗原基因構建到慢病毒載體plvx-ires-g418里，最后進行質粒抽提；

40、2)轉染前24h將對數生長期293t細胞鋪6孔板；

41、3)轉染當天將慢病毒載體質粒、輔助質粒pspax2質粒以及pmd2g質粒按質量比2：1：1稀釋于opti-mem培養基中，輕輕混勻，將3倍質量的聚乙烯亞胺(pei)轉染試劑加到稀釋好的質粒中，輕輕混勻，室溫靜置15min；

42、4)取出hek-293t細胞，將上述體系逐滴加入到培養板中，輕輕晃勻，放入溫箱培養；

43、5)取轉染后72h的慢病毒顆粒上清，1500rpm離心5分鐘，再用0.45μm濾頭過濾病毒上清，收集病毒上清。

44、更優選地，所述的步驟s2中，sv40永生化慢病毒感染，包括如下步驟：

45、1)以2.5e5?cell/ml密度接種羊駝腎原代細胞，24h后進行病毒感染。

46、2)移除原培養基，加入含感染增強劑的完全培養基，再加入適量的慢病毒sv40(大t?antigen)進行孵育。所述的感染增強劑為f108，所述的完全培養基是含20％fbs及1％p/s的rpmi?1640培養基，感染增強劑在完全培養基中的含量為1％。為了增強病毒感染，將細胞置于水平離心機400g，32度離心60min。離心后將細胞放入37度co2培養箱中。

47、3)感染6h后去除含病毒溶液，加入完全培養基，繼續培養48h。

48、更優選地，所述的步驟s3，永生化羊駝腎細胞的抗性篩選，包括如下步驟：將細胞擴培后，加入g418抗生素進行抗性篩選，待細胞處于生長對數期，且細胞活率達到95％以上，將細胞按照1×106細胞/管進行凍存。

49、在本發明的第三方面，提供了如第一方面所述的永生化羊駝腎細胞系在構建羊駝腎細胞過表達human?cd19的穩定細胞株中的應用。

50、所述的過表達human?cd19的穩定細胞株的構建方法包括如下步驟：

51、s1：復蘇和培養永生化羊駝腎細胞；

52、s2：依據human?cd19序列信息，表達plvx-ires-human?cd19-puro慢病毒質粒；

53、s3：用步驟s2獲得的humancd19的慢病毒去感染永生化的羊駝腎細胞；

54、s4：驗證s3所獲得的羊駝腎細胞-human?cd19的穩定細胞株的表達量。

55、本發明還提供了利用如第三方面所述制備方法制得的羊駝腎細胞過表達humancd19的穩定細胞株。

56、在本發明的第四方面，提供了如第一方面所述的永生化羊駝腎細胞系在構建羊駝腎細胞過表達alpaca?cd40lg的穩定細胞株中的應用。

57、所述的過表達alpaca?cd40lg的穩定細胞株的構建方法包括如下步驟：

58、s1：復蘇和培養永生化羊駝腎細胞；

59、s2：依據alpaca?cd40lg序列信息，構建plvx-ires-hygromycin-alpaca?cd40lg慢病毒質粒；

60、s3：用步驟s2獲得的alpaca?cd40lg的慢病毒去感染永生化的羊駝腎細胞；

61、s4：驗證s3所獲得的羊駝腎細胞-alpaca?cd40lg的穩定細胞株的表達量。

62、本發明還提供了利用如第四方面所述制備方法制得的羊駝腎細胞過表達alpacacd40lg的穩定細胞株。

63、在本發明的第五方面，提供了如第一方面所述的永生化羊駝腎細胞系作為病毒感染機制研究工具細胞的應用。

64、在本發明的第六方面，提供了如第一方面所述的永生化羊駝腎細胞系作為藥物體外功能檢測工具細胞的應用。

65、在本發明的第七方面，提供了如第一方面所述的永生化羊駝腎細胞系作為抗體藥物開發與篩選工具細胞的應用。

66、與現有技術相比，本發明的有益效果如下：

67、1)從實施例1的圖3可以看出，本發明構建的永生化羊駝腎細胞具備培養簡單、可多次傳代、均一性好、構建外源基因表達量高等優點，從實施例1的圖4可以看出，所建立的永生化羊駝腎細胞增殖快速，倍增時間在40小時，且不同密度的細胞增殖速度保持一致。因此本發明的永生化羊駝腎細胞系將為羊駝免疫的研究提供更為有力的工具細胞，有望提升國內羊駝細胞免疫研究平臺。

68、2)本發明構建的永生化羊駝腎細胞系為病毒感染機制、藥物體外功能檢測、抗體藥物開發與篩選提供了新工具，應用前景廣闊。

69、本發明涉及的微生物的保藏信息如下：

70、保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)；

71、保藏單位地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號；

72、分類命名：永生化羊駝腎細胞(alpaca?kidney?cells)bnalpaca?1.0；

73、保藏編號：cgmcc?no.46058；

74、保藏日期：2024年10月24日。