本發(fā)明涉及生物檢測(cè)及其相關(guān)臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用，，尤其涉及用于評(píng)估脂肪健康狀態(tài)的脂肪組織代謝健康相關(guān)基因及其檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、日前，全球肥胖人口顯著增加，(肥胖癥)已成為一種世界性的流行疾病，造成巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。肥胖的診斷與防治需要通過(guò)多種生物標(biāo)志物檢測(cè)，全面評(píng)估個(gè)體的代謝狀態(tài)和炎癥水平。在血液檢測(cè)中，空腹血糖、胰島素水平和血脂譜(包括膽固醇和甘油三酯)通常通過(guò)生化分析儀進(jìn)行測(cè)量。此外，瘦素和脂聯(lián)素的水平通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)來(lái)評(píng)估體脂調(diào)節(jié)，而高敏感性c反應(yīng)蛋白(crp)檢測(cè)用于評(píng)估炎癥程度。在尿液檢測(cè)中，肌酐和微量白蛋白水平可通過(guò)生化分析評(píng)估腎功能。對(duì)于組織檢測(cè)，脂肪組織的基因表達(dá)分析通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr和rna測(cè)序進(jìn)行，幫助理解脂質(zhì)代謝與炎癥機(jī)制。圖像學(xué)方法如雙能x線吸收法(dexa)和磁共振成像(mri)用于準(zhǔn)確測(cè)量體脂分布。新興技術(shù)如代謝組學(xué)和微生物組分析則進(jìn)一步擴(kuò)展了對(duì)肥胖機(jī)制的理解；其中，代謝組學(xué)通過(guò)核磁共振和質(zhì)譜分析研究代謝物變化，而微生物組分析研究腸道菌群與肥胖的關(guān)系。這些檢測(cè)技術(shù)共同為個(gè)性化肥胖干預(yù)提供了科學(xué)依據(jù)，有助于制定有效的預(yù)防和治療策略。

2、除了上述間接指標(biāo)外，也有研究對(duì)脂肪組織健康狀態(tài)進(jìn)行直接檢測(cè)，目前監(jiān)測(cè)脂肪組織健康狀態(tài)的代謝標(biāo)志物主要包括游離脂肪酸、瘦素、脂聯(lián)素、腺苷、以及一些炎癥因子如c反應(yīng)蛋白(crp)和腫瘤壞死因子α(tnf-α)。有一些研究提取脂肪組織中的rna，并使用實(shí)時(shí)定量pcr(qpcr)或rna測(cè)序技術(shù)(rna-seq)分析特定基因的表達(dá)水平。常關(guān)注的基因包括與代謝、炎癥和脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的基因，例如pparγ、fabp4、tnf-α等。通過(guò)比較不同組別(如健康組與肥胖相關(guān)代謝綜合癥組)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，評(píng)估脂肪組織的代謝健康狀態(tài)，并使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)確定基因表達(dá)差異的顯著性。

3、但目前各檢測(cè)手段存在以下不足：(1)傳統(tǒng)的肥胖相關(guān)防治標(biāo)志物檢測(cè)，如抽血、基因篩查、糞便微生物菌群分析等，操作復(fù)雜，而且這些方法主要以間接標(biāo)志或代謝風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估為主，缺乏對(duì)脂肪組織的直接評(píng)估檢測(cè)，以反映病人的肥胖相關(guān)病理狀態(tài)指標(biāo)。(2)雖然目前也有研究對(duì)脂肪組織中脂肪代謝健康相關(guān)的基因進(jìn)行直接檢測(cè)，但這些研究中，檢測(cè)指標(biāo)較為常規(guī)，缺乏創(chuàng)新性；而且，對(duì)應(yīng)的研究多用于科研領(lǐng)域，并沒(méi)有成套試劑盒對(duì)脂肪組織這些相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；再者，目前通常對(duì)于脂肪組織的取材和分析方法操作復(fù)雜，對(duì)操作人員專業(yè)技術(shù)要求高，在臨床工作中大范圍運(yùn)用困難，限制了它們的實(shí)用性和普及程度。

4、脂肪組織，作為核心的能量存儲(chǔ)器官，與肥胖的發(fā)生和發(fā)展直接密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明，腹壁脂肪組織的樣本采集能提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)來(lái)研究脂肪細(xì)胞功能、炎癥標(biāo)志物變化以及基因表達(dá)等。與傳統(tǒng)間接檢測(cè)血液指標(biāo)不同，對(duì)脂肪組織進(jìn)行直接快速檢測(cè)，不僅能提供更為直觀的代謝健康狀態(tài)信息，還對(duì)理解肥胖機(jī)制有重要意義。

5、現(xiàn)有技術(shù)雖然已經(jīng)有通過(guò)皮下腹部獲取脂肪組織樣本，例如檢測(cè)hmga2和ppar-γ基因水平，進(jìn)行肥胖、糖尿病、心血管疾病和代謝綜合征等疾病的預(yù)測(cè)和/或診斷；還有基于實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)食蟹猴脂肪組織中fabp4基因表達(dá)量。但目前仍缺乏成套的脂肪組織中脂肪代謝健康相關(guān)的基因檢測(cè)試劑盒。

6、g蛋白偶聯(lián)受體120(gpr120)屬于中長(zhǎng)鏈脂肪酸受體家族，其參與調(diào)節(jié)體內(nèi)一系列的代謝過(guò)程，如激素分泌、細(xì)胞增殖及脂質(zhì)生成等，研究發(fā)現(xiàn)gpr120參與體內(nèi)糖及脂質(zhì)代謝、改善胰島素抵抗和抑制炎癥反應(yīng)等過(guò)程；gpr120在骨質(zhì)疏松的治療及骨代謝穩(wěn)態(tài)方面、抗腫瘤方面均發(fā)揮著一定的作用；gpr120可用于預(yù)測(cè)卵巢癌侵襲性與不良預(yù)后。pla2g5是一種磷脂酶a2家族成員，其在免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，參與多種生物學(xué)事件的發(fā)生發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)分泌型pla2g5在炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)研究了與脂肪組織健康相關(guān)的新基因(genome-wide?discovery?ofgenetic?loci?that?uncouple?excess?adiposity?from?its?comorbidities)，但其不涉及pla2g5、gpr120及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因。因此，目前并未有研究報(bào)道pla2g5、gpr120及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因與脂肪組織代謝健康狀態(tài)的關(guān)系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少一個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明對(duì)脂肪組織代謝健康相關(guān)基因進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)pla2g5、gpr120及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因、瘦素和脂聯(lián)素可作為健康代謝脂肪組織的標(biāo)志物；本發(fā)明還提供一種脂肪組織代謝健康相關(guān)基因表達(dá)快速檢測(cè)試劑盒，其直接以脂肪組織作為樣本，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪組織的直接且快速的評(píng)估。上述研究及構(gòu)建的檢測(cè)試劑盒有效克服了下述技術(shù)問(wèn)題：(1)傳統(tǒng)的肥胖相關(guān)防治標(biāo)志物檢測(cè)主要以間接標(biāo)志或代謝風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估為主，缺乏對(duì)與肥胖直接相關(guān)的脂肪組織的評(píng)估；(2)傳統(tǒng)的脂肪組織代謝健康研究方法操作和分析相對(duì)復(fù)雜，成本高，對(duì)操作分析人員專業(yè)水平要求高，僅限于實(shí)驗(yàn)室科研，難以臨床推廣；(3)對(duì)脂肪組織中脂肪代謝健康相關(guān)的基因進(jìn)行直接檢測(cè)目前多限于科研，缺乏成套試劑盒，在臨床工作中大范圍運(yùn)用困難；(4)對(duì)脂肪組織中脂肪代謝健康相關(guān)的基因進(jìn)行直接檢測(cè)的現(xiàn)有研究指標(biāo)較為常規(guī)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供脂肪組織代謝健康相關(guān)基因作為評(píng)估脂肪健康狀態(tài)的標(biāo)志物的應(yīng)用，其中，所述脂肪組織代謝健康相關(guān)基因包括pla2g5(ⅴ組磷脂酶a2)、gpr120(g蛋白偶聯(lián)受體120)及其下游信號(hào)通路基因中的至少一種。

4、進(jìn)一步地，所述gpr120的下游信號(hào)通路基因包括glut4(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4)、insr(胰島素受體，其中胰島素受體底物irs是insr的效應(yīng)蛋白)、pi3k(磷脂酰肌醇3-激酶)、akt(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶b)、erk1/2(細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2)。

5、進(jìn)一步地，所述脂肪組織代謝健康相關(guān)基因還包括脂肪因子基因。

6、進(jìn)一步地，所述脂肪因子基因包括瘦素、脂聯(lián)素。

7、進(jìn)一步地，所述脂肪組織代謝健康相關(guān)基因還包括脂代謝和脂肪分解相關(guān)基因。

8、進(jìn)一步地，所述脂肪分解相關(guān)基因包括fasn(脂肪酸合酶)、srebf1(固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1)、pparγ(過(guò)氧化物酶增殖活化受體γ)、lpl(脂蛋白脂肪酶)、hsl(激素敏感性脂肪酶)、atgl(脂肪三酸酯脂肪酶)、fabp4(脂肪酸結(jié)合蛋白4)。

9、進(jìn)一步地，所述脂肪組織選自眼眶脂肪、腹部皮下脂肪、血清中的脂肪組織。優(yōu)選，所述脂肪組織為腹部皮下脂肪中的脂肪組織。

10、本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種用于檢測(cè)脂肪組織代謝健康相關(guān)基因表達(dá)的試劑盒，其中，所述脂肪組織代謝健康相關(guān)基因?yàn)榈谝粋€(gè)方面中任一所述的脂肪組織代謝健康相關(guān)基因。

11、進(jìn)一步地，所述試劑盒包括脂肪組織裂解液、qpcr預(yù)混液、引物預(yù)制板、封板膜。上述試劑盒還可包括說(shuō)明書(shū)，以用于說(shuō)明各試劑的組成成分及試劑盒的操作步驟。

12、進(jìn)一步地，所述試劑盒通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)脂肪組織代謝健康相關(guān)基因的表達(dá)情況。

13、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品和陰陽(yáng)性對(duì)照，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

14、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括脂肪組織采集裝置，其可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的活檢針、麻醉活檢針等，采用的脂肪組織經(jīng)過(guò)樣本預(yù)處理后可直接進(jìn)行脂肪組織脂質(zhì)代謝物的檢測(cè)。

15、具體地，上述試劑盒的檢測(cè)方法為：通過(guò)快速rna純化，去除雜質(zhì)，然后使用高效逆轉(zhuǎn)錄酶和特異性設(shè)計(jì)的引物將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna；接下來(lái)，在熒光定量pcr儀上進(jìn)行pcr擴(kuò)增，taq聚合酶和特異性引物對(duì)負(fù)責(zé)擴(kuò)增脂代謝相關(guān)基因，利用熒光染料或探針實(shí)時(shí)檢測(cè)pcr產(chǎn)物，通過(guò)熒光信號(hào)監(jiān)控基因的擴(kuò)增過(guò)程。

16、本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種第二個(gè)方面中任一所述的試劑盒的應(yīng)用，其選自以下應(yīng)用中的至少一種：在評(píng)估肥胖癥和代謝綜合征相關(guān)基因表達(dá)水平中的應(yīng)用；在評(píng)估受試者脂肪組織代謝健康狀態(tài)中的應(yīng)用；在篩選用于防治肥胖癥和代謝綜合征相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

17、具體地，上述試劑盒應(yīng)用領(lǐng)域包括：科研領(lǐng)域的脂肪組織代謝研究，臨床篩查中對(duì)肥胖癥和代謝綜合征相關(guān)基因表達(dá)水平的快速評(píng)估，以及藥物研發(fā)中治療干預(yù)措施對(duì)基因表達(dá)影響的評(píng)估等。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用上述技術(shù)方案具有以下有益效果：

19、(1)本發(fā)明創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)pla2g5、gpr120及其下游信號(hào)通路可以作為評(píng)估脂肪健康狀態(tài)的標(biāo)志基因，并實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行快速檢測(cè)；

20、(2)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)肥胖相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)的復(fù)雜性問(wèn)題且缺乏對(duì)與肥胖直接相關(guān)的脂肪組織的評(píng)估，本發(fā)明引入了脂肪組織直接評(píng)估的快速試劑盒，通過(guò)對(duì)脂肪組織其代謝相關(guān)基因表達(dá)的直接檢測(cè)，提供對(duì)脂肪組織的直接且快速的評(píng)估，生成更準(zhǔn)確的個(gè)體病理狀態(tài)數(shù)據(jù)，相比間接指標(biāo)更具臨床實(shí)用性和診斷價(jià)值；

21、(3)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)脂肪組織直接檢測(cè)方法的操作復(fù)雜性和高成本問(wèn)題，本發(fā)明構(gòu)建的試劑盒降低了對(duì)操作人員的技術(shù)要求，簡(jiǎn)化步驟，使其可以在更大規(guī)模上應(yīng)用，從而提升肥胖相關(guān)疾病的早期檢測(cè)與管理治療效果。