本發明涉及基因工程領域，特別是針對一種用于基因敲除和敲入的供體片段的構建方法。

背景技術：

1、同源重組(homologous?recombination)是指發生在非姐妹染色單體(non-sisterchromatid)之間或同一染色體上含有同源序列的dna分子之間或分子之內的重新組合?；谕粗亟M的基因組編輯具有脫靶少甚至無脫靶、無殘留等優點。

2、在大腸桿菌基因工程領域，基于λ噬菌體red操縱子的red同源重組系統是使用最為廣泛的同源重組系統之一。

3、使用大腸桿菌red系統同源重組系統進行大腸桿菌基因插入時，需要構建供體片段，傳入片段，再以overlap-pcr將上游片段、下游片段、插入片段構建成完整的供體片段。構建過程失敗率高，突變可能性大。

技術實現思路

1、本發明提出了一種基于吉布森組裝和pcr的敲除和敲入用同源重組所需供體片段的構建方法，能有效地降低供體片段構建過程中供體片段出現突變的風險，提高供體片段構建的成功率，最快可在2輪pcr即3天內完成敲除和敲入供體片段的初步構建。

2、為了實現上述目標，本發明采用如下的技術方案：

3、一種用于基因敲除和敲入的供體片段的構建方法,包括如下步驟：

4、(1)根據基因組序列設計引物1與引物2，對基因組進行pcr，獲得基因組片段；

5、(2)根據質粒序列設計引物3與引物4，將質粒或攜帶質粒的目標細胞進行pcr獲得線性化質粒；

6、(3)將(1)獲得的基因組片段以及(2)獲得的線性化質粒純化后進行吉布森組裝獲得重組質粒；

7、(4)重組質粒轉化到的目標細胞進行篩選獲得重組成功的轉化子；

8、(5)設計引物5與引物6對(4)中的獲得的轉化子進行pcr擴增，純化后通過吉布森組裝引物5與引物6所得的片段；

9、(6)將(5)中的片段轉化到目標細胞進行篩選后獲得攜帶供體片段的轉化子；

10、(7)將(6)中的轉化子通過pcr或酶切法獲得供體片段。

11、根據本發明的實施例，所述步驟(5)中通過設計引物7與引物8加入待插入基因與轉化子經過pcr擴增后的片段，純化后共同通過吉布森組裝獲得重組質粒；所述引物7與引物8依據pcr待敲入片段與整合供體片段的連接處的序列設計。

12、根據本發明的實施例，所述步驟(3)中重組質粒當由質粒進行pcr時，通過用dpni酶進行切割。

13、根據本發明的實施例，所述步驟(1)中的引物1與引物2依據需要敲除或敲入的兩端序列設計。引物1和引物2設計依據是基因組定點敲入需求，想插在基因組哪個區段內部就在哪個區段兩端設計引物；吉布森組裝依賴同源臂，該同源臂可以在插入片段上(注：此情況引物3/4帶待插入片段同源臂)，也可以在質粒骨架上(注：此情況引物1/2帶質粒同源臂)。

14、根據本發明的實施例，所述步驟(2)中的引物3與引物4依據pcr線性化質粒與供體片段整合處序列設計。引物3和引物4設計依據是將引物1和引物2pcr所得片段整合入想整合的質粒，因此引物3和引物4的設計依據是質粒上的插入位點。

15、根據本發明的實施例，所述步驟(5)中的引物5與引物6依據需要敲除或敲入的兩端序列設計。

16、根據本發明的實施例，所述的目標細胞為a673細胞、cho-s細胞、cho細胞、vero細胞、sf9細胞、293f細胞、hek293t細胞、植物細胞、釀酒酵母菌、產油酵母、茶酵母、啤酒酵母、斯氏油脂酵母、紅法夫酵母、產阮假絲酵母、異型酒香酵母、裂殖酵母、烏瓦酵母、維哈克莫酵母、畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、二裂酵母、克魯維酵母、白色隱球菌、米曲霉、碳曲霉、頂頭孢霉、灰霉菌、產黃青霉、黑根霉、根霉、四孢脂霉、哈茨木霉、小根霉、假木霉、多孢木霉、尼泊爾重霉、泡盛曲霉、灰黃青霉、赭曲霉、費氏曲霉、潮解木霉、粉紅單端孢霉、毛霉、短帚霉、韋氏曲霉、黑曲霉、農霉菌、變異霉菌、托米木霉、枸櫞木霉、菌核青霉、烏瓦曲霉、短青霉、意大利青霉、柑橘青霉、黃曲霉、煙曲霉、里氏木霉、紅曲霉、黃曲霉、構巢曲霉、委內瑞拉鏈霉菌、波塞鏈霉菌、白鏈霉菌、灰鏈霉菌、白芥鏈霉菌、嗜熱鏈球菌、微黃鏈霉菌、玫瑰孢鏈霉菌、葡萄球菌、霍亂弧菌、銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、單增李斯特菌、熒光假單胞菌、牙齦卟啉單胞菌、洋蔥假單胞菌、運動假單胞菌、惠特莫爾氏假單胞菌、斯氏假單胞菌、產堿假單胞菌、惡臭假單胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎軍團菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、大腸桿菌nissle、巴氏醋桿菌、糞腸球菌、檸檬酸腸桿菌、布魯氏桿菌、豬鏈球菌、果膠桿菌、炭疽桿菌、肺炎克雷伯菌、谷氨酸棒桿菌、腸炎沙門氏菌、粘質沙雷氏菌、沙門氏菌、鼠李糖乳桿菌菌、凝乳桿菌、肉毒桿菌、短小芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、節桿菌、類芽孢桿菌、安全芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、紫羅蘭色桿菌、巴氏芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、天藍色鏈霉菌、幽門螺桿菌、山羊念珠菌、白色念珠菌、副念珠菌、中間念珠菌、光滑念珠菌、念珠菌、氧化亞鐵硫桿菌、結核分枝桿菌、嗜酸乳桿菌、加利納腸球菌、乳酸乳球菌、加維乳球菌、干酪乳桿菌、紅球菌、杜鵑紅球菌、副豬嗜血桿菌、恥垢分支桿菌、農桿菌、短乳桿菌、氧化亞鐵硫桿菌、跟癌農桿菌、巴氏桿菌、羅伊氏乳桿菌、鮑曼不動桿菌、乳雙歧桿菌、明亮發光桿菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸菌、康枇馬拉色菌、馬拉色菌、居泉沙雷氏菌、囊泡黃單胞菌、喬木黃單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、溫和氣單胞菌、米黃單胞菌、尖刀鐮刀菌、木糖鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、茄鐮刀菌、增殖鐮刀菌、中華根瘤菌、厚根緩瘤菌、志賀氏菌、志賀氏痢疾桿菌、毛葡萄孢菌、格特隱球菌、麥角菌、河生來略特氏菌、貪銅鉤蟲菌、溶壁微球菌、藤黃微球菌、具核梭菌、棘白菌、馬疫鏈球菌、棘球菌、戊糖片球菌、白僵菌、綠僵菌、青?；【?、哈維氏弧菌、需鈉弧菌、裂殖壺菌、艱難梭菌、衣藻、尋常小球藻團藻、聚球藻、附紅細胞體、前放線菌、珍貴束絲放線菌、游動放線菌、東方擬無枝酸菌、褐球固氮菌、腐敗希瓦氏菌任意一種。

17、根據本發明的實施例，所述步驟(4)或(6)中的篩選方法為抗生素平板篩選、熒光篩選、產氣篩選、顯色篩選中的任意一種。

18、本發明的有益效果在于：

19、1.減少了pcr次數，在載體構建過程中降低了突變的可能性。

20、2.降低了勞動強度，減少了試劑用量。

21、3.本方法可以有效的減少轉化次數，用于定點編輯供體片段構建時，最快可在二輪pcr內完成供體片段的制備，能顯著的縮短供體片段的構建時長。

技術特征：

1.一種用于基因敲除和敲入的供體片段的構建方法,包括如下步驟，

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中通過設計引物7與引物8加入待插入基因與轉化子經過pcr擴增后的片段，純化后共同通過吉布森組裝獲得重組質粒；所述引物7與引物8依據pcr待敲入片段與整合供體片段的連接處的序列設計。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)中重組質粒當由質粒進行pcr時，通過用dpni酶進行切割。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的引物1與引物2依據需要敲除或敲入的兩端序列設計。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的引物3與引物4依據pcr線性化質粒與供體片段整合處序列設計。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟(5)中的引物5與引物6依據需要敲除或敲入的兩端序列設計。

7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的目標細胞為a673細胞、cho-s細胞、cho細胞、vero細胞、sf9細胞、293f細胞、hek293t細胞、植物細胞、釀酒酵母菌、產油酵母、茶酵母、啤酒酵母、斯氏油脂酵母、紅法夫酵母、產阮假絲酵母、異型酒香酵母、裂殖酵母、烏瓦酵母、維哈克莫酵母、畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、二裂酵母、克魯維酵母、白色隱球菌、米曲霉、碳曲霉、頂頭孢霉、灰霉菌、產黃青霉、黑根霉、根霉、四孢脂霉、哈茨木霉、小根霉、假木霉、多孢木霉、尼泊爾重霉、泡盛曲霉、灰黃青霉、赭曲霉、費氏曲霉、潮解木霉、粉紅單端孢霉、毛霉、短帚霉、韋氏曲霉、黑曲霉、農霉菌、變異霉菌、托米木霉、枸櫞木霉、菌核青霉、烏瓦曲霉、短青霉、意大利青霉、柑橘青霉、黃曲霉、煙曲霉、里氏木霉、紅曲霉、黃曲霉、構巢曲霉、委內瑞拉鏈霉菌、波塞鏈霉菌、白鏈霉菌、灰鏈霉菌、白芥鏈霉菌、嗜熱鏈球菌、微黃鏈霉菌、玫瑰孢鏈霉菌、葡萄球菌、霍亂弧菌、銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、單增李斯特菌、熒光假單胞菌、牙齦卟啉單胞菌、洋蔥假單胞菌、運動假單胞菌、惠特莫爾氏假單胞菌、斯氏假單胞菌、產堿假單胞菌、惡臭假單胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎軍團菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、大腸桿菌nissle、巴氏醋桿菌、糞腸球菌、檸檬酸腸桿菌、布魯氏桿菌、豬鏈球菌、果膠桿菌、炭疽桿菌、肺炎克雷伯菌、谷氨酸棒桿菌、腸炎沙門氏菌、粘質沙雷氏菌、沙門氏菌、鼠李糖乳桿菌菌、凝乳桿菌、肉毒桿菌、短小芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、節桿菌、類芽孢桿菌、安全芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、紫羅蘭色桿菌、巴氏芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、天藍色鏈霉菌、幽門螺桿菌、山羊念珠菌、白色念珠菌、副念珠菌、中間念珠菌、光滑念珠菌、念珠菌、氧化亞鐵硫桿菌、結核分枝桿菌、嗜酸乳桿菌、加利納腸球菌、乳酸乳球菌、加維乳球菌、干酪乳桿菌、紅球菌、杜鵑紅球菌、副豬嗜血桿菌、恥垢分支桿菌、農桿菌、短乳桿菌、氧化亞鐵硫桿菌、跟癌農桿菌、巴氏桿菌、羅伊氏乳桿菌、鮑曼不動桿菌、乳雙歧桿菌、明亮發光桿菌、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸菌、康枇馬拉色菌、馬拉色菌、居泉沙雷氏菌、囊泡黃單胞菌、喬木黃單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、溫和氣單胞菌、米黃單胞菌、尖刀鐮刀菌、木糖鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、茄鐮刀菌、增殖鐮刀菌、中華根瘤菌、厚根緩瘤菌、志賀氏菌、志賀氏痢疾桿菌、毛葡萄孢菌、格特隱球菌、麥角菌、河生來略特氏菌、貪銅鉤蟲菌、溶壁微球菌、藤黃微球菌、具核梭菌、棘白菌、馬疫鏈球菌、棘球菌、戊糖片球菌、白僵菌、綠僵菌、青?；【?、哈維氏弧菌、需鈉弧菌、裂殖壺菌、艱難梭菌、衣藻、尋常小球藻團藻、聚球藻、附紅細胞體、前放線菌、珍貴束絲放線菌、游動放線菌、東方擬無枝酸菌、褐球固氮菌、腐敗希瓦氏菌任意一種。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)或(6)中的篩選方法為抗生素平板篩選、熒光篩選、產氣篩選、顯色篩選中的任意一種。

技術總結
本發明涉及基因工程領域，特別是針對一種用于基因敲除和敲入的供體片段的構建方法：(1)根據基因組序列設計引物對基因組進行PCR；(2)根據質粒序列設計引物將質?；驍y帶質粒的目標細胞進行PCR；(3)將(1)獲得的基因組片段以及(2)獲得的線性化質粒純化后進行吉布森組裝；(4)重組質粒轉化到的目標細胞進行篩選獲得重組成功的轉化子；(5)設計引物對(4)中的獲得的轉化子進行PCR擴增，純化后通過吉布森組裝；(6)將(5)中的片段轉化到目標細胞進行篩選后獲得攜帶供體片段的轉化子；(7)將(6)中的轉化子通過PCR或酶切法獲得供體片段。本發明本方法可以有效的減少基因擴增次數和轉化次數，降低突變發生的概率，縮短供體片段的構建時長，減輕實驗人員的勞動強度，節約試劑。

技術研發人員：請求不公布姓名
受保護的技術使用者：杭州元騰生物工程股份有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24