本發(fā)明涉及生物，尤其是涉及一種特異性識(shí)別2′-巖藻糖基乳糖的ssdna適配體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人乳寡糖(human?milk?oligosaccharides,hmos)是母乳中具有豐富生理活性的一大類寡糖的統(tǒng)稱，也是母乳中含量?jī)H次于乳糖和脂肪的第三大的營(yíng)養(yǎng)成分，在嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到了不可替代的重要作用。2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-fl)是hmos中含量最高的中性寡糖，占母乳中hmos含量的約30％。2′-fl已被證實(shí)具有益生元活性、抗黏附抗菌特性、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)大腦發(fā)育等多種生理功能。目前，2′-fl已正式被中國(guó)、美國(guó)、歐盟、澳大利亞和新西蘭等批準(zhǔn)成為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑或嬰幼兒配方奶粉新型添加劑，在嬰幼兒配方奶粉、調(diào)制乳粉(兒童用)，以及特殊醫(yī)學(xué)嬰兒食品中極具應(yīng)用前景。隨著2'-fl作為新興食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑大規(guī)模進(jìn)入市場(chǎng)，大規(guī)模制備2′-fl的技術(shù)開(kāi)發(fā)和工廠建設(shè)成為熱點(diǎn)，因此，確立快速且可批量的檢測(cè)方法變得尤為迫切。另外，由于某些母親體內(nèi)特定基因的缺失，其母乳中不含2'-fl，這使得她們的子女面臨更高的克羅恩氏病、膿毒病等患病風(fēng)險(xiǎn)，但目前醫(yī)院還未開(kāi)展針對(duì)母乳成分多態(tài)性的檢測(cè)。因此，將2'-fl的檢測(cè)方法應(yīng)用于母乳成分分析，可以幫助母親們根據(jù)母乳的具體成分，為嬰兒提供及時(shí)的膳食補(bǔ)充，從而預(yù)防對(duì)嬰兒健康產(chǎn)生不良影響。綜上所述，開(kāi)發(fā)能夠快速且大規(guī)模檢測(cè)2'-fl的方法，具有多方面的實(shí)際應(yīng)用意義。

2、目前，對(duì)2′-fl的檢測(cè)和定量分析仍局限于常規(guī)儀器分析法，包括高效液相色譜法，反相高效液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、以及毛細(xì)管電泳法、核磁共振法等。然而，國(guó)內(nèi)外都尚未出臺(tái)關(guān)于2′-fl檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。且由于分析儀器價(jià)格昂貴、實(shí)驗(yàn)成本高、對(duì)樣品要求高以及整體耗時(shí)較長(zhǎng)等因素，較難滿足大規(guī)模檢測(cè)的需求，從而限制了2′-fl的檢測(cè)通量。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、高通量的2′-fl檢測(cè)新方法顯得尤為迫切。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是為了克服現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法快速、高通量的檢測(cè)2′-巖藻糖基乳糖，從而提供一種特異性識(shí)別2′-巖藻糖基乳糖的ssdna適配體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明的技術(shù)方案之一為提供一種特異性識(shí)別2′-巖藻糖基乳糖的ssdna適配體，其核苷酸序列如seq?id?no.1或5所示。

4、seq?id?no.1(5′-3′)：

5、ataggagtcacgacgaccag-taggtcgataaaacaagtacagctggtg?ga-tatgtgcgtctacctcttga

6、seq?id?no.5(5′-3′)：

7、ataggagtcacgacgaccaggccgtaggactgggcatatctgccacgcgttatgtgcgtctacctcttgattttttattccgacctcattaagcagc

8、本發(fā)明的技術(shù)方案之二為提供一種如上述技術(shù)方案之一所述的ssdna適配體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

9、s1、將初始單鏈dna文庫(kù)與核苷酸序列如seq?id?no.2所示的帶標(biāo)記的互補(bǔ)短鏈p3混合孵育，構(gòu)建雜交文庫(kù)；

10、所述初始單鏈dna文庫(kù)中的核苷酸序列為如seq?id?no.11所示的通式，通式中，n代表堿基a，t，g，c中的任意一個(gè)，n30代表長(zhǎng)度為30個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列區(qū)域；

11、seq?id?no.2(互補(bǔ)短鏈p3，5′-3′)：tcaagaggtagac

12、作為優(yōu)選的，所述互補(bǔ)短鏈p3經(jīng)生物素修飾標(biāo)記，即為：

13、5′-biotin-tcaagaggtagac-3′。

14、seq?id?no.11(初始單鏈dna文庫(kù)，5′-3′)：

15、5′-ataggagtcacgacgaccag-n30-tatgtgcgtctacctcttga-3′。

16、s2、向s1步驟構(gòu)建的雜交文庫(kù)中加入鏈霉親和素磁珠，構(gòu)建固定于磁珠表面的ssdna初始文庫(kù)；

17、s3、向s2步驟構(gòu)建的固定于磁珠表面的ssdna初始文庫(kù)中加入靶標(biāo)2′-巖藻糖基乳糖進(jìn)行孵育，磁分離后收集上清，得到含有能夠與2′-巖藻糖基乳糖結(jié)合的ssdna單鏈，為靶標(biāo)-ssdna復(fù)合物，并以靶標(biāo)-ssdna復(fù)合物為模板，以正向引物p1和一端修飾有磷酸基團(tuán)的反向引物p2作為引物對(duì)，擴(kuò)增得到dsdna，其中，正向引物p1和反向引物p2的核苷酸序列分別如seq?id?no.3-4所示；

18、seq?id?no.3(正向引物p1，5′-3′)：ataggagtcacgacgaccag；

19、seq?id?no.4(反向引物p2，5′-3′)：tcaagaggtagacgcacata。

20、s4、通過(guò)酶切s3步驟中dsdna的磷酸化鏈，制備單鏈，獲得次級(jí)ssdna文庫(kù)；

21、s5、將s4步驟得到的次級(jí)ssdna文庫(kù)經(jīng)多次重復(fù)s1～s4步驟進(jìn)行操作，根據(jù)qpcr熔解曲線確定重復(fù)的輪數(shù)，直至最后一次pcr擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序；

22、s6、根據(jù)序列重復(fù)性或穩(wěn)定性、親和性、特異性，從s5步驟獲得的測(cè)序結(jié)果中篩選得到特異性識(shí)別2′-巖藻糖基乳糖的ssdna適配體。

23、在一些具體實(shí)施方式中，于s1步驟，初始單鏈dna文庫(kù)與核苷酸序列如seq?idno.2所示的帶標(biāo)記的互補(bǔ)短鏈的摩爾比為1:1.5，孵育的條件為95℃孵育10min，立即置于冰浴。

24、在一些具體實(shí)施方式中，于s2步驟，構(gòu)建ssdna初始文庫(kù)的具體方法包括：將雜交文庫(kù)與鏈霉親和素磁珠以1:300的質(zhì)量比混合，并于37℃，160rpm條件下混合孵育4h，磁分離后棄去上清液，得到固定于磁珠表面的雜交文庫(kù)，為ssdna初始文庫(kù)。

25、在一些具體實(shí)施方式中，于s5步驟，根據(jù)qpcr熔解曲線確定重復(fù)的輪數(shù)的判斷依據(jù)為：當(dāng)qpcr反應(yīng)過(guò)程中，pcr產(chǎn)物的熔解溫度達(dá)到最大且峰值不再上升時(shí)，為最后一輪的重復(fù)。

26、在一些具體實(shí)施方式中，于s5步驟，在重復(fù)過(guò)程中，于s3步驟中還加入3-巖藻糖基化乳糖和/或l-巖藻糖和/或乳糖作為反篩靶標(biāo)，與固定于磁珠表面的ssdna初始文庫(kù)中的序列先進(jìn)行孵育，棄去與反篩靶標(biāo)結(jié)合的序列，再與正篩靶標(biāo)2’-巖藻糖基乳糖進(jìn)行孵育，得到特異性提高的靶標(biāo)-ssdna復(fù)合物。

27、本發(fā)明的技術(shù)方案之三為提供一種如上述ssdna適配體的應(yīng)用，所述ssdna適配體用于制備檢測(cè)2′-巖藻糖基乳糖的生物傳感器。

28、在一些具體實(shí)施方式中，所述生物傳感器為ssdna適配體與crispr/cas12a耦合的熒光生物傳感器，

29、所述熒光生物傳感器的傳感部分包括磁珠、固定于磁珠表面并與ssdna適配體端部互補(bǔ)配對(duì)并帶有標(biāo)記的短鏈ssdna、ssdna適配體-dsdna雜交鏈，其中，dsdna與ssdna適配體端部互補(bǔ)配對(duì)；

30、所述熒光生物傳感器的檢測(cè)部分包括crrna、cas12a蛋白和熒光探針。

31、在一些具體實(shí)施方式中，當(dāng)所述ssdna適配體的核苷酸序列如seq?id?no.5所示時(shí)：

32、所述短鏈ssdna的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

33、所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no.12所示，所述crrna由crrna?t7-f和crrnat7-r聚合成模板dna，再經(jīng)轉(zhuǎn)錄后得到，其中crrna?t7-f和crrna?t7-r的核苷酸序列如seqid?no.9-10所示；

34、所述熒光探針的核苷酸序列如ttatt所示；

35、所述ssdna適配體-dsrna雜交鏈通過(guò)如下步驟制得：

36、將ssdna適配體、dsdna-f、dsdna-r、緩沖液混合，于95℃孵育5min，冷卻至室溫，得到ssdna適配體-dsrna雜交鏈，

37、其中，dsdna-f、dsdna-r的核苷酸序列如seq?id?no.7-8所示。

38、seq?id?no.6(短鏈ssdna，5′-3′)：gtcgtgactcctatttttttttttt

39、作為優(yōu)選的，所述短鏈ssdna為經(jīng)生物修飾標(biāo)記，即為：

40、5′-gtcgtgactcctatttttttttttt-biotin-3′

41、seq?id?no.7(dsdna-f，5′-3′)：

42、tgagccatgtatccaggtcatttgtccctatcagtgatagagaagctct?gacagttcca

43、seq?id?no.8(dsdna-r，5′-3′)：

44、tggaactgtcagagcttctctatcactgatagggacaaatgacctggatacatggctcagctgcttaatgaggtcggaat

45、熒光探針的核苷酸序列：ttatt

46、作為優(yōu)選的，熒光探針為fq熒光探針，兩端分別包括fam熒光基團(tuán)和bhq-1淬滅基團(tuán)，即為：fam-ttatt-bhq-1

47、seq?id?no.12(crrna，5′-3′)：5'-ucccuaucagugauagag-3'

48、在一些具體實(shí)施方式中，所述ssdna適配體與crispr/cas12a耦合的熒光生物傳感器的檢測(cè)范圍為0.18～11.72μmol/l和0.93～3mmol/l。

49、在一些具體實(shí)施方式中，當(dāng)所述ssdna適配體與crispr/cas12a耦合的熒光生物傳感器的檢測(cè)范圍為0.18～11.72μmol/l，線性方程滿足y＝606.29ln(x)-727.09，其中y表示體系的熒光強(qiáng)度，x表示2′-巖藻糖基乳糖的濃度。

50、在一些具體實(shí)施方式中，當(dāng)所述ssdna適配體與crispr/cas12a耦合的熒光生物傳感器的檢測(cè)范圍為0.93～3mmol/l時(shí)，線性方程滿足y＝180.15ln(x)+4681.32，其中y表示體系的熒光強(qiáng)度，x表示2′-巖藻糖基乳糖的濃度。

51、本發(fā)明ssdna適配體與crispr/cas12a耦合的熒光生物傳感器可用于2′-巖藻糖基乳糖的檢測(cè)，當(dāng)向上述的適配體傳感器體系中加入靶標(biāo)2′-巖藻糖基乳糖后，2′-巖藻糖基乳糖會(huì)與ssdna適配體發(fā)生特異性結(jié)合使適配體形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由于適配體與靶標(biāo)結(jié)合的親和力大于適配體與短鏈ssdna的結(jié)合力，因此將適配體競(jìng)爭(zhēng)性的從短鏈ssdna上脫離，從而促使與靶標(biāo)結(jié)合后的適配體-dsdna脫離磁珠，進(jìn)入到體系的上清液中。通過(guò)磁力架進(jìn)行分離，上清液中即為與2′-巖藻糖基乳糖結(jié)合的適配體-dsdna，將其加入到cas12a信號(hào)系統(tǒng)中進(jìn)行熒光檢測(cè)。其中cas12a蛋白的反式切割活性切割位點(diǎn)存在于dsdna序列中，將上述上清液中的適配體-dsdna加入到cas12a蛋白與crrna形成的復(fù)合體中時(shí)，cas12a蛋白靶向切割dsdna后發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化，從而激活cas12a蛋白的反式切割活性，游離于體系中的單鏈熒光探針被快速切割，其兩端的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，進(jìn)而在激發(fā)光的照射下熒光基團(tuán)恢復(fù)其熒光信號(hào)用于檢測(cè)，即cas12a信號(hào)系統(tǒng)可以將上清液中游離的適配體-dsdna轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)適配體-dsdna的定量檢測(cè)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)2′-巖藻糖基乳糖的檢測(cè)。

52、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

53、(1)本發(fā)明通過(guò)文庫(kù)固定化capture-selex技術(shù)，基于鏈霉親和素磁珠間接將初始篩選文庫(kù)進(jìn)行固定。相較于固定靶標(biāo)可能產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)，文庫(kù)固定化技術(shù)確保了靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的充分暴露，有利于提高篩選出的適配體與靶標(biāo)的親和性，進(jìn)而提升了適配體在后續(xù)應(yīng)用中的效能。

54、(2)本發(fā)明通過(guò)篩選獲得與2′-巖藻糖基乳糖特異性結(jié)合的ssdna適配體，并將其作為2′-巖藻糖基乳糖檢測(cè)的識(shí)別元件，與crispr/cas12a體系耦合，利用cas12a蛋白的反式切割活性，構(gòu)建了一種適配體-crispr/cas12a熒光生物傳感器，對(duì)信號(hào)實(shí)現(xiàn)了快速響應(yīng)及放大。該方法相比于傳統(tǒng)的2′-巖藻糖基乳糖檢測(cè)方法，具有高效、快速以及高通量檢測(cè)的特點(diǎn)，能夠滿足嬰幼兒配方乳粉和配方食品中對(duì)2′-巖藻糖基乳糖用量的檢測(cè)范圍，同時(shí)也擴(kuò)大了線性檢測(cè)的范圍，為2′-巖藻糖基乳糖的快速檢測(cè)提供了新方法。