本技術涉及一種用于檢測呼出氣中微生物(如結核分枝桿菌)的呼出氣富集面罩，屬于醫療檢測領域。

背景技術：

1、結核病(tb)因其可在人與人之間傳播、且發病率和死亡率高，仍然是世界范圍內的一個主要公共衛生問題。2021年，全球約有800萬新增有記錄病例，此外，還有約410萬結核病患者因未得到及時診斷而被遺漏，尤其是在第三世界國家?？刂苩b傳播和降低死亡率的關鍵是及時、準確地診斷人群中的傳染源。結核病(tb)由結核分枝桿菌(mtb)引起，主要通過空氣傳播，健康人吸入感染者在咳嗽、打噴嚏、說話或吐痰時以氣溶膠形式釋放的活mtb而致使感染。tb的感染方式致使其高流行率和高傳播率，也使得早期診斷tb變得更為困難?，F階段，結核分枝桿菌的常規檢測方法包括培養法、成像檢測、痰涂片鏡檢、血清學檢測和分子診斷。然而，這些診斷方式大多以痰液作為樣本，檢測耗時長、依賴大型設備、需要專業技術人員。痰液作為tb分析的主要臨床樣本，是一種特別難獲得和處理的基質，且需要在實驗室環境中采集和分析。此外，痰液樣本對兒童、hiv感染者、肺外tb患者的診斷敏感性低。這些問題已成為開展廣泛的結核病篩查的瓶頸。

2、一個理想的能夠在資源有限地區開展的傳染病篩查的護理點(point?of?care，poc)檢測設備應該是快速、經濟、準確、無創、順應性好、操作簡單的。呼出氣樣本作為一種常用的非侵入性采樣方法，被廣泛認為是一種有前景的結核病診斷策略。相較于痰液、血清和尿液樣本中的復雜組成，呼出氣成分簡單，主要包括小分子、脂肪、蛋白質、病原體。呼出氣樣本多采用無創的收集方式，操作簡單、患者順應性好，更利于結核病的早期診斷和疾病監測。近期，benjamin?patterson等的研究提示肺結核患者可能存在非咳嗽傳播，并證實結核病患者呼出氣中含有可培養的mtb，采集呼出氣樣本進行檢測是可行和可重復的。

3、目前，已經開發了各種利用呼出氣樣本進行疾病診斷的poc平臺。如zhu?tong等人通過集成硅納米線場效應晶體管(sinw)傳感器設備、微流體和生物氣溶膠空氣采樣技術，開發的空氣傳播的h3n1流感病毒的實時監測系統；sousa等人開發的一種靜電空氣采樣器，用于采集結核病患者的咳嗽樣本；ruth?mcnerney等人設計了一款利用免疫傳感器和生物光學技術的新型裝置rbs呼吸測定儀系統以實現人體呼吸中結核分枝桿菌抗原檢測。遺憾的是，上述呼出氣檢測設備，均借助復雜、精密、昂貴的呼出氣收集裝置，且需儀器輔助完成檢測。因此，利用收集呼出氣中病原微生物進行結核病診斷的poc檢測仍是具有挑戰性的。

4、因呼出氣樣本中病原體含量較低，需要結合信號放大策略進行檢測。核酸等溫擴增技術因其靈敏度高、特異性強、快速(5-60分鐘)、無需專用設備的優點，越來越廣泛的被用于病原體poc檢測。常見的等溫擴增技術有滾環擴增(rca)、環介導等溫擴增(lamp)、解旋酶依賴型擴增(hda)和重組酶聚合酶擴增(rpa)等，在眾多新興的核酸等溫擴增技術中，rpa技術由于其反應所需溫度低(25-42℃)、擴增能力強、體系簡單、樣本耐受度高，雖然出現較晚，但發展迅速，已成為研發poc檢測方法的熱門技術。此外，側向流動分析(lfa)作為一種可視化的信號讀取方法，已廣泛的被應用于病原體核酸檢測。如wansadaj?jaroenram等人開發了一種lamp結合側向流試紙可視化檢測痰液中mtb的方法?？上У氖牵@種等溫擴增依靠復雜的引物設計，且診斷所采用的依然為痰液樣本，復雜的樣本前處理過程也不適用于poc檢測。正是因為mtb在呼出氣中含量較低，樣品損耗高，對檢測方法的靈敏度要求高，目前還未有研究通過核酸分析檢測呼出氣中的mtb實現tb診斷。

技術實現思路

1、本實用新型的目的在于提供一種檢測呼出氣中細菌的檢測方法，解決現有技術依賴于檢測痰液來篩查呼吸道傳染病而導致的耗時長、復雜、成本高、病人順應性差等問題，提供一種適宜于在資源有限地區護理點開展傳染病(如肺結核)篩查的快速、經濟、準確、無創、順應性好、操作簡單的檢測設備及其檢測方法。

2、在本實用新型中，我們首次設計組裝了一款結合心肺復蘇(cpr)急救面罩與n95口罩的呼出氣中病原微生物富集口罩(n95呼出氣富集口罩，n95-enrichment-respirator,n95-er)，并成功應用于結核病診斷平臺。n95口罩因其優越的病原微生物阻隔能力(pm2.5阻隔率大于95％)，而被廣泛應用于傳染病防護領域。此外，用于急救時防止急救人員與傷者交叉感染接觸的cpr急救面罩，因其耐酸、耐堿、耐腐蝕、耐高溫、可高溫消毒、可反復使用的優點，在本實用新型被應用于呼出氣的收集。相較于現有的呼出氣收集裝置，n95-er成本低廉、組裝簡單、操作簡單、富集效率高，更利于批量生產與推廣使用。因此，本實用新型所設計的n95-er更適合用于富集呼出氣中mtb從而實現tb診斷的檢測設備。

3、為了實現上述目的，本實用新型提供了一種用于檢測呼出氣中細菌的呼出氣富集面罩，其組成為在心肺復蘇面罩的基礎上，將心肺復蘇面罩原有的單向閥更換為用于呼出氣中細菌捕獲與富集的濾閥，該濾閥由閥蓋、濾芯、閥底三部分組成，其中所述濾芯從內到外依次為無紡布、熔噴布、熱風棉、熔噴布、無紡布5層。

4、本實用新型涉及一種檢測呼出氣中細菌的檢測方法，包括以下步驟：s1富集呼出氣中微生物；s2洗脫微生物；s3從洗脫液提取微生物核酸；s4等溫擴增；s5檢測微生物核酸，所述步驟s1通過呼出氣富集面罩來富集呼出氣中微生物，所述步驟s3通過電裂解法提取微生物核酸，所述步驟s4為rpa等溫擴增，所述步驟s5通過側向流分析實驗檢測結果。

5、本實用新型的一種用于檢測呼出氣中細菌的呼出氣富集面罩用于前述一種檢測呼出氣中細菌的檢測方法的步驟s1。采用富集面罩來采集病人的呼出氣，是為了取代了傳統的痰液樣本的檢測方法。痰液樣本必須是病人清晨早起時候的深痰，而且必須通過深咳才可能獲得符合要求(例如含有結核菌)的痰液，且必須在具備一定條件的醫療單位內，專業人員來收集。而采集病人呼出氣，無需特殊時間無需特殊地點，使病人佩戴口罩足夠的時間就可以滿足檢測要求。使用本實用新型的呼出氣富集面罩富集的富集效率遠遠高于微流控芯片富集，可以做到快速。而芯片富集的誤差相對較低。

6、在步驟s2中優選我們自行研發的配合于s1的呼出氣富集面罩的最優的洗脫方法，以獲得最優的洗脫效率。

7、在步驟s3中可選的核酸提取方式有機械裂解、酶裂解、化學裂解、電裂解等，優選采用直流電細菌核酸提取微流控芯片的電裂解，其具有時間短、小型化、低消耗、集成化、樣品量小、避免化學試劑污染等優點。

8、在步驟s4中可選的核酸擴增方式有滾環擴增(rca)、環介導等溫擴增(lamp)、解旋酶依賴型擴增(hda)和重組酶聚合酶擴增(rpa)等，優選rpa核酸擴增法，其具有反應所需溫度低(25-42℃)、擴增能力強、體系簡單、樣本耐受度高的優點。

9、在步驟s5中可選的核酸檢測方式有側向流動分析(lfa)、實時熒光定量pcr(rt-qpcr)等，優選lfa，其可以采用lfa試紙檢測，具有檢測快速、操作方便、可視化等優點。rt-qpcr則作為成熟的檢測手段可以驗證lfa結果的正確性。

10、如果采用呼出氣富集面罩富集+洗脫+芯片電裂解+rpa+lfa的流程檢測，檢測全過程不超過1.5小時，無需大型儀器輔助，患者在家即可獨立完成檢測，更適合結核病的大規模篩查。而且操作簡單、靈敏度高、成本低廉，可以預期其應用擴展到其他氣溶膠傳染病診斷和感染檢測。這對于廣大醫療資源匱乏的地區的呼吸道疾病檢測具有非常大的優勢，大大降低成本，也減輕了病人和醫療工作者的負擔，解決長期以來想解決而未解決的技術難題。