本發明涉及發酵工程，尤其涉及一種α-1,2-巖藻糖基轉移酶的突變體及其應用。

背景技術：

1、人乳低聚糖（human?milk?oligosaccharides，hmos）是母乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大固體成分，在人乳中含量為2~5g/l。hmos在嬰兒健康中發揮著重要作用，hmos可作為益生元，具有調節腸道菌群增強腸道屏障，促進嬰幼兒免疫系統發育和提高大腦及認知發育等多方面益處。目前已鑒定出200種人乳低聚糖，根據其組成單體，可分為唾液酸化乳糖、中性化乳糖以及巖藻糖基化乳糖。

2、2'-巖藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose，2'-fl）是巖藻糖基化乳糖的一種，在人乳低聚糖中含量最高，約占人乳低聚糖的30%。此外，相關研究表明2'-fl具有預防腸道疾病、提高免疫力、促進大腦發育等作用。2'-巖藻糖基乳糖的從頭合成經甘露糖-6-磷酸異構酶mana、磷酸甘露糖變位酶manb、甘露糖-1-磷酸鳥苷轉移酶manc、gdp-d-甘露糖-4,?6-脫水酶gmd和gdp-巖藻糖合酶wcag多步轉化合成gdp-l-巖藻糖，底物gdp-l-巖藻糖和乳糖經過α-1,2-巖藻糖基轉移酶催化合成2'-巖藻糖基乳糖。

3、在2'-fl的合成過程中，由于α-1,2-巖藻糖基轉移酶的不專一性，具有α-1,3-巖藻糖基轉移活性，容易生成副產物3-巖藻糖基乳糖（3-fl）和乳糖二巖藻四糖（dfl），這限制了2'-fl的生產，增大了2'-fl產物純化的提純難度。

技術實現思路

1、為了解決現有技術存在的問題，本發明提供一種α-1,2-巖藻糖基轉移酶的突變體及其應用。

2、第一方面，本發明提供一種α-1,2-巖藻糖基轉移酶的突變體，所述突變體為在α-1,2-巖藻糖基轉移酶的氨基酸序列的基礎上，包括如下任意一種或多種突變：k125d、a242c、y269a、p284l或v292l。

3、本發明如上突變的表述方式為本領域常用的表述方式，以k125d為例，125位該突變在尿苷5′-二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖2差向異構酶上的位置，k為突變前的氨基酸類型（賴氨酸），d為突變后的氨基酸類型（天冬氨酸），即第125位的賴氨酸被天冬氨酸取代；a242c表示第242位的丙氨酸被半胱氨酸取代；y269a表示第269位的酪氨酸被丙氨酸取代；p284l表示第284位的脯氨酸被取代亮氨酸；v292l表示第292位的纈氨酸被取代亮氨酸。

4、進一步地，所述突變體為在α-1,2-巖藻糖基轉移酶的氨基酸序列的基礎上，包括如下任意一種：

5、i）突變k125d和y269a；

6、ii）在i）的基礎上還包括突變a242c。

7、進一步地，所述α-1,2-巖藻糖基轉移酶來源于 escherichia?colio126。

8、進一步地，所述α-1,2-巖藻糖基轉移酶包括如下任意一種氨基酸序列：

9、（1）如seq?id?no.1所示的氨基酸序列；

10、（2）如seq?id?no.1所示的氨基酸序列經一個或多個氨基酸的替換、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

11、進一步地，所述α-1,2-巖藻糖基轉移酶的編碼基因包括如下任意一種核苷酸序列：

12、（1）如seq?id?no.2所示的核苷酸序列；

13、（2）如seq?id?no.2所示的核苷酸序列經過一個或多個核苷酸的替換、缺失或插入獲得的能夠編碼具有相同功能蛋白的核苷酸序列；

14、（3）在嚴格條件下可以與如seq?id?no.2所示的核苷酸序列進行雜交的核苷酸序列。

15、第二方面，本發明提供前述的突變體在提高大腸桿菌生產2'-巖藻糖基乳糖能力中的應用。

16、本發明進一步提供前述的突變體在降低大腸桿菌生產2'-巖藻糖基乳糖過程中的雜質水平的應用；

17、所述雜質優選包括乳糖二巖藻四糖和3-巖藻糖基乳糖。

18、進一步地，所述大腸桿菌為具備2'-巖藻糖基乳糖生產能力的大腸桿菌，所述突變體導入或整合于所述大腸桿菌的基因組中；

19、優選地，所述大腸桿菌降低了lacz、wcaj和nudd基因的表達水平。

20、進一步地優選地，所述大腸桿菌還包括：manb、manc、gmd和wcag基因。以上基因彼此獨立整合或以任意組合共同整合于所述基因工程菌的基因組中，或者，存在于所述基因工程菌攜帶的重組質粒中，其基因可源于外源基因或內源基因。

21、本發明所述lacz為β-半乳糖苷酶基因，wcaj為udp-葡萄糖脂質載體轉移酶基因，nudd為gdp-甘露糖基水解酶基因，manb為磷酸甘露糖變位酶基因，manc為甘露糖-6-磷酸鳥苷轉移酶基因，gmd為gdp-甘露糖-1,4-脫水酶基因，wcag為gdp-巖藻糖合酶基因。

22、本發明所述降低了lacz、wcaj和nudd基因的表達水平可以采用本領域常用的降低基因表達水平的技術手段實現，例如基因敲除造成基因片段的缺失或基因的完全敲除，或采用rna干擾等手段。同時，降低基因表達水平包括了不同程度的基因水平降低，包括功能完全喪失。

23、第三方面，本發明提供一種提高大腸桿菌生產2'-巖藻糖基乳糖能力的方法，包括：采用前述的突變體替代大腸桿菌中的α-1,2-巖藻糖基轉移酶，或，將前述的突變體導入大腸桿菌中。

24、進一步地，通過質粒轉染、cacl2轉化、電穿孔或噬菌體轉化中的一種或多種方式將突變體導入大腸桿菌中。

25、第四方面，本發明提供一種大腸桿菌，所述大腸桿菌由前述方法制備得到。

26、本發明具有如下有益效果：

27、本發明提供多種α-1,2-巖藻糖基轉移酶的突變體，其具有較高的催化活性和專一性，在導入大腸桿菌之后可以顯著提升2'-巖藻糖基乳糖的產量，并且降低副產物乳糖二巖藻四糖和3-巖藻糖基乳糖的產量，從而解決提高2'-巖藻糖基乳糖的生產性能及發酵過程中副產物生成的問題，具有較高的經濟價值。

技術特征：

1.一種α-1,2-巖藻糖基轉移酶的突變體，其特征在于，所述突變體為在α-1,2-巖藻糖基轉移酶的氨基酸序列的基礎上，包括如下任意一種或多種突變：k125d、a242c、y269a、p284l或v292l。

2.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體為在α-1,2-巖藻糖基轉移酶的氨基酸序列的基礎上，包括如下任意一種：

3.根據權利要求1或2所述的突變體，其特征在于，所述α-1,2-巖藻糖基轉移酶來源于escherichia?coli?o126。

4.根據權利要求3所述的突變體，其特征在于，所述α-1,2-巖藻糖基轉移酶包括如下任意一種氨基酸序列：

5.根據權利要求4所述的突變體，其特征在于，

6.權利要求1-5任一項所述的突變體在提高大腸桿菌生產2'-巖藻糖基乳糖能力中的應用。

7.權利要求1-5任一項所述的突變體在降低大腸桿菌生產2'-巖藻糖基乳糖過程中的雜質水平的應用；

8.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于，所述大腸桿菌為具備2'-巖藻糖基乳糖生產能力的大腸桿菌，所述突變體導入或整合于所述大腸桿菌的基因組中；

9.一種提高大腸桿菌生產2'-巖藻糖基乳糖能力的方法，其特征在于，包括：采用權利要求1-5任一項所述的突變體替代大腸桿菌中的α-1,2-巖藻糖基轉移酶，或，將權利要求1-5任一項所述的突變體導入或整合于所述大腸桿菌的基因組中。

10.一種大腸桿菌，其特征在于，由權利要求9所述的方法制備得到。

技術總結
本發明涉及發酵工程技術領域，尤其涉及一種α?1,2?巖藻糖基轉移酶的突變體及其應用。所述突變體為在α?1,2?巖藻糖基轉移酶的氨基酸序列的基礎上，包括如下任意一種或多種突變：K125D、A242C、Y269A、P284L或V292L。本發明提供多種α?1,2?巖藻糖基轉移酶的突變體，這些突變體可以有效提高大腸桿菌生產2'?巖藻糖基乳糖的能力，并且抑制雜質的產生。本發明提供的α?1,2?巖藻糖基轉移酶的突變體可以在提高2'?巖藻糖基乳糖產量的同時解決發酵過程中副產物生成的問題，這在2'?巖藻糖基乳糖生產領域具有重要意義。

技術研發人員：陳祥松,李翔宇,勞才問,劉玲,袁麗霞,姚建銘
受保護的技術使用者：嘉必優生物技術（武漢）股份有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28