本發明屬于基因，具體地，涉及一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白及其編碼基因和表達方法。

背景技術：

1、膠原蛋白是結締組織中極其重要的結構蛋白質，其生物活性使其能參與細胞遷移、分化和繁殖，使結締組織具有機械強度，此外還能促進細胞生長，具有止血、生物相容性、生物降解性等性質。膠原蛋白被廣泛的應用于醫學材料及藥物方面、美容化妝品、保健品以及各種實用工業中。至今已發現30余種膠原蛋白鏈的編碼基因，可以形成16種以上膠原蛋白分子，常見類型為i、ⅱ、ⅲ、v和?型，其中ⅲ型膠原蛋白主要存在于嬰兒的皮膚或血管內膜、腸道上及成人軟骨、玻璃體、椎間盤上等。ⅲ型膠原蛋白（clo3a1）的合成能力很強，能夠在創傷修復中將來源于骨髓的干細胞分化成幫助修復的纖維細胞。因此，在生物醫藥工程中，ⅲ型膠原蛋白在修復組織創傷、支撐細胞再組、改善皮膚狀態、提升皮膚彈性與柔嫩度等方面應用更為廣泛。

2、目前工業上制備膠原蛋白的方法主要為傳統提取法或從微生物中提取。利用動物組織如豬皮、牛皮、驢皮等進行酸、堿、鹽、酶處理來獲取膠原蛋白，采用動物來源制備的膠原蛋白，雖然操作方法簡單、回收率高，但在應用中存在安全隱患，工藝中未能除盡非膠原供體蛋白和生物因子殘留，提取的產品還存在攜帶動物源病毒的風險隱患，直接應用于人體會產生免疫排斥反應，極大地限制了其在生物醫學領域的應用范圍。使用微生物獲得人型膠原片段，在生產過程中產生很多代謝廢物，需進行處理，耗時耗力。目前，已經將植物表達系統視為動物細胞和微生物培養的有前景替代物，用于大規模生產重組蛋白。利用植物作為底盤生產重組蛋白質的生產方法可以參見例如：中國專利cn107827975和cn106554971等。

3、目前如何利用植物系統更好地表達重組iii型人源化膠原蛋白仍是需要深入探討的問題，也是本研究團隊致力于解決的問題。

技術實現思路

1、本發明所要解決的技術問題是提供一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白及其編碼基因和表達方法。

2、為解決上述問題，本發明所采取的技術方案是：

3、技術主題一：

4、本發明提供一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白，其氨基酸序列如seqid?no.1所示。

5、技術主題二：

6、本發明提供一種如技術主題一所述的一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的編碼基因，基因序列如seq?id?no.2所示。

7、作為本發明的進一步實施方案，表達所述基因的受體植物為水培植物生菜。

8、技術主題三：

9、本發明提供一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的表達方法，步驟如下：

10、s1、序列設計：選取人iii型膠原蛋白的編碼區（cds區）基因序列，根據受體植物密碼子特性進行優化，添加酶切位點，得到重組iii型人源化膠原蛋白基因序列；

11、s2、重組表達載體的構建：將含有重組iii型人源化膠原蛋白基因序列的菌株和含有質粒的菌株進行擴大培養，經質粒提取后將其酶切，得到目的基因片段和線性化質粒，使用連接酶連接后，轉化入大腸桿菌，對轉化后的大腸桿菌進行篩選并擴大培養，經質粒提取，得到重組表達載體；

12、s3、轉化：將得到的重組表達載體轉化入農桿菌內；

13、s4、侵染：水培受體植物，獲取受體植物，浸沒于含有重組質粒的農桿菌菌液侵染液中，負壓處理，完成侵染；

14、s5、蛋白提取及純化：將農桿菌侵染后的受體植物進行液氮冷凍研磨，得到植物粉末，加入蛋白提取液提取植物總蛋白，得到植物總蛋白提取液，其純化后得到重組iii型人源化膠原蛋白。

15、作為本發明的進一步實施方案，s2所述質粒為peaq-ht。

16、作為本發明的進一步實施方案，s2所述酶切所用內切酶為agei和xhol；s2所述連接酶為t4連接酶。

17、作為本發明的進一步實施方案，所述農桿菌為農桿菌lba4404。

18、作為本發明的進一步實施方案，所述負壓處理為置于-0.10~-0.09mpa條件下處理3~10分鐘。

19、作為本發明的進一步實施方案，所述植物粉末與蛋白提取液用量之比為1g：1~3ml。

20、作為本發明的進一步實施方案，所述純化為：將植物總蛋白提取液加入到平衡好的重力柱中，保留2~5分鐘，反復上樣2~5遍；用含有3~10mm咪唑的洗雜液洗去雜蛋白；用含有150~450mm咪唑的洗脫液加入重力柱，洗脫重組iii型人源化膠原蛋白。

21、采用上述技術方案的原理及所產生的有益效果在于：

22、1、本發明以水培植物生菜作為受體，避免了動物提取的病毒性感染風險和細菌的內源蛋白表達；植物比微生物有更高層次的生理結構，更易獲得類人的結構和成分以及組織；以水培生菜為受體植物生產重組iii型人源化膠原蛋白，提高了目的蛋白的純度，同時生產周期短、生產成本較低、易于實現大規模生產。

23、2、本發明所得重組iii型膠原蛋白基因序列中含有his標簽，易于純化，有利于得到高純度重組iii型人源化膠原蛋白。

24、3、本發明所得重組iii型人源化膠原蛋白，具有熱穩定性，其熱變性溫度在18℃左右，高于直接從深海紅鮭魚皮中提取的天然膠原蛋白的熱變性溫度（15.9℃）；同時其達到熱變性溫度后降解速度緩慢，在一定熱變性溫度范圍內仍能揮維持部分蛋白的基本結構，延長了蛋白達到熱變性溫度后的有效時間。

技術特征：

1.一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seqid?no.1所示。

2.一種如權利要求1所述的水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的編碼基因，其特征在于，基因序列如seq?id?no.2所示。

3.根據權利要求2所述的水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的編碼基因，其特征在于，表達所述基因的受體植物為水培植物生菜。

4.一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的表達方法，其特征在于，步驟如下：

5.根據權利要求4所述的一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的表達方法，其特征在于，s2所述質粒為peaq-ht。

6.根據權利要求4所述的一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的表達方法，其特征在于，s2所述酶切使用的內切酶為agei和xhol；s2所述連接酶為t4連接酶。

7.根據權利要求4所述的一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的表達方法，其特征在于，所述農桿菌為農桿菌lba4404。

8.根據權利要求4所述的一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的表達方法，其特征在于，所述負壓處理為置于-0.10~-0.09mpa條件下處理3~10分鐘。

9.根據權利要求4所述的一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的表達方法，其特征在于，所述植物粉末與蛋白提取液用量之比為1g：1~3ml。

10.根據權利要求4所述的一種水培植物表達的重組iii型人源化膠原蛋白的表達方法，其特征在于，所述純化為：將植物總蛋白提取液加入到平衡好的重力柱中，保留2~5分鐘，反復上樣2~5遍；用含有3~10mm咪唑的洗雜液洗去雜蛋白；用含有150~450mm咪唑的洗脫液加入重力柱，洗脫重組iii型人源化膠原蛋白。

技術總結
本發明屬于基因技術領域，具體地，涉及一種水培植物表達的重組III型人源化膠原蛋白及其編碼基因和表達方法，所得重組Ⅲ型人源化膠原蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，編碼基因序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明公開的水培植物表達重組III型人源化膠原蛋白的技術內容，為水培植物表達重組III型人源化膠原蛋白提供了一種新方案。采用水培植物生菜作為受體植物，所得重組III型人源化膠原蛋白安全無毒；同時其熱變性溫度高于某些動物提取的天然膠原蛋白，具有一定的熱穩定性，表現出了重要的實用價值和實踐意義。

技術研發人員：宋靈杰,王琪,楊洋,張艷,耿珂晗,史冬暖,武曉靜,劉益克
受保護的技術使用者：宋靈杰
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28