本發(fā)明涉及作物遺傳育種、作物新資源創(chuàng)新領(lǐng)域，具體而言，一種結(jié)球甘藍(lán)突變型基因及其在桔紅心結(jié)球甘藍(lán)育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、結(jié)球甘藍(lán)屬于十字花科(brassicaceae)蕓薹屬(brassica)，為二年生或多年生結(jié)球類蔬菜，起源于歐洲地中海至北海沿岸。因結(jié)球甘藍(lán)口感脆嫩和營(yíng)養(yǎng)豐富，可涼拌、炒食、腌制以及加工成脫水蔬菜，已成為我國(guó)居民餐桌上必不可少的菜品。目前，結(jié)球甘藍(lán)在我國(guó)的栽培面積已達(dá)90余萬(wàn)公頃，在我國(guó)蔬菜出口貿(mào)易以及周年供應(yīng)中均有著極其重要的地位。近年來(lái)，隨著我國(guó)全面建成小康社會(huì)和居民生活水平的提高，我國(guó)蔬菜正從數(shù)量保障型向營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)型轉(zhuǎn)變，城鄉(xiāng)居民對(duì)蔬菜品質(zhì)提出了更高要求。因此，改良結(jié)球甘藍(lán)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀已逐漸成為未來(lái)的育種方向。

2、結(jié)球甘藍(lán)的品質(zhì)性狀包括外觀品質(zhì)、口感品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，其中營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)是指由一系列具有營(yíng)養(yǎng)和保健功能的物質(zhì)所構(gòu)成，包括類胡蘿卜素、膳食纖維、維生素、碳水化合物、礦質(zhì)元素等。類胡蘿卜素是結(jié)球甘藍(lán)中一類重要的營(yíng)養(yǎng)成分,是人體內(nèi)維生素a的主要來(lái)源,具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、延緩衰老等保健功效。蔬菜的可食用器官的顏色越偏向黃色、橙色或紅色，其類胡蘿卜素的含量往往越高。例如桔紅心大白菜富含前番茄紅素、番茄紅素和β-胡蘿卜素。迄今為止，國(guó)內(nèi)乃至世界上，還沒(méi)有桔紅心結(jié)球甘藍(lán)種質(zhì)和商業(yè)品種應(yīng)用的報(bào)道，嚴(yán)重影響了結(jié)球甘藍(lán)類胡蘿卜素含量的遺傳改良。

3、種質(zhì)資源創(chuàng)制方法主要有雜交育種、誘變育種以及基因編輯育種。相比于前兩種方法，基因編輯可高效而精準(zhǔn)的實(shí)現(xiàn)基因插入、缺失或替換，從而改變其遺傳信息和性狀。因此，利用基因編輯可高效創(chuàng)制桔紅心結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)。然而，利用基因編輯創(chuàng)制桔紅心結(jié)球甘藍(lán)需要解決靶基因的問(wèn)題。當(dāng)前，由于沒(méi)有桔紅心結(jié)球甘藍(lán)種質(zhì)，導(dǎo)致無(wú)法通過(guò)正向遺傳學(xué)對(duì)結(jié)球甘藍(lán)的桔紅心基因進(jìn)行鑒定。目前，大白菜的桔紅心基因已經(jīng)被鑒定為crtiso基因，該基因功能丟失后會(huì)導(dǎo)致前番茄紅素異構(gòu)化受阻，從而引起大白菜出現(xiàn)桔紅心表型。本研究組的前期研究顯示結(jié)球甘藍(lán)全基因組中只存在唯一的crtiso基因，并且使用體外酶活實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了crtiso具有前番茄紅素異構(gòu)酶的活性，是結(jié)球甘藍(lán)中潛在的桔紅心基因。因此，利用基因編輯敲除結(jié)球甘藍(lán)crtiso基因，極有可能獲得桔紅心結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)，為推進(jìn)結(jié)球甘藍(lán)類胡蘿卜素含量性狀育種的快速發(fā)展具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是調(diào)控結(jié)球甘藍(lán)菜心顏色。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了下述應(yīng)用。

3、降低所述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在下任一種中的應(yīng)用；

4、a1)制備桔紅心甘藍(lán)和/或生產(chǎn)制備桔紅心甘藍(lán)產(chǎn)品中的應(yīng)用；

5、a2)桔紅心甘藍(lán)育種和/或生產(chǎn)制備桔紅心甘藍(lán)育種產(chǎn)品中的應(yīng)用；

6、所述蛋白質(zhì)為如下任一種：

7、b1)氨基酸序列是序列20所示的蛋白質(zhì)；

8、b2)將b1)所述蛋白質(zhì)的經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與b1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

9、b3)將b1)或b2)的n末端或/和c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。

10、上述的應(yīng)用中，所述蛋白來(lái)源于結(jié)球甘藍(lán)。

11、上述的應(yīng)用中，所述降低所述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為下述任一種：

12、b1)、降低上述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)的核酸分子；

13、b2)、表達(dá)b1)所述核酸分子的編碼基因；

14、b3)、含有b2)所述基因的表達(dá)盒；

15、b4、含有b2)所述基因的重組載體、或含有b3)所述表達(dá)盒的重組載體；

16、b5)、含有b2)所述基因的重組微生物、或含有b3)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有b4)所述重組載體的重組微生物。

17、上述的應(yīng)用中，b1)所述核酸分子的靶標(biāo)基因?yàn)樾蛄?2所示。

18、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種培育桔紅心甘藍(lán)的方法。

19、所述方法包括降低目的甘藍(lán)中如上任一所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)量，得到桔紅心甘藍(lán)的步驟。

20、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種降低甘藍(lán)菜心明度的方法。

21、所述方法包括降低目的甘藍(lán)中如上任一所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)量，得到低明度菜心甘藍(lán)，所述低明度菜心甘藍(lán)的菜心的明度低于所述目的甘藍(lán)。

22、上述的方法中，所述降低甘藍(lán)中如上任一所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)包括向所述目的甘藍(lán)中導(dǎo)入上述中b1)所述的核酸分子、b2)所述基因的表達(dá)盒、b3)所述的表達(dá)盒或b4)所述的重組載體。

23、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種培育桔紅心甘藍(lán)的方法。

24、所述方法包括將甘藍(lán)基因組中序列22的第324位的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸殘基進(jìn)行缺失突變，獲得桔紅心甘藍(lán)。

25、如上任一所述的應(yīng)用或如上任一所述的方法中，所述甘藍(lán)為結(jié)球甘藍(lán)。

26、如上任一所述應(yīng)用或如上任一所述方法，所述桔紅心甘藍(lán)的結(jié)球期菜心為桔紅色，或，低明度菜心甘藍(lán)的結(jié)球期菜心的明度低于目的甘藍(lán)。

27、有益效果：相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn)：

28、1)本發(fā)明首次通過(guò)基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)結(jié)球甘藍(lán)crtiso基因的定點(diǎn)突變，再通過(guò)對(duì)t1代植株的篩選，在t1代獲得了無(wú)外源t-dna片段的、桔紅心表型穩(wěn)定遺傳的結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)，該新種質(zhì)除了表現(xiàn)為桔紅心性狀之外，其他的表型無(wú)明顯變化。與常規(guī)的誘變育種和雜交育種相比，基因編輯育種只需要2-3年即可完成，具有高效、精準(zhǔn)等優(yōu)勢(shì)，縮短了育種周期，應(yīng)用前景十分廣闊。

29、2)本發(fā)明利用基因編輯創(chuàng)制的crtiso-tp基因在indel-c08:50542693位點(diǎn)上的變異為本專利首創(chuàng)。通過(guò)與甘藍(lán)泛基因組的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)由119份甘藍(lán)材料構(gòu)成的甘藍(lán)泛基因組中均不存在indel-c08:50542693的變異。

30、3)本專利基于野生型與突變體在indel-c08:50542693位置處的序列差異，開(kāi)發(fā)了能夠特異區(qū)分野生型(crtiso編碼序列第324位堿基為t)和突變體(crtiso編碼序列第324位堿基為g)的kasp分子標(biāo)記，可應(yīng)用于結(jié)球甘藍(lán)分子標(biāo)記輔助育種。

31、4)本發(fā)明利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制得到的結(jié)球甘藍(lán)種質(zhì)在蓮座期生長(zhǎng)點(diǎn)表現(xiàn)為桔紅色，越往外葉色越綠。該種質(zhì)在結(jié)球期，其外葉為正常綠色，但球葉越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)，顏色為桔黃色。切球后球內(nèi)顏色為桔紅色。本發(fā)明首創(chuàng)了桔紅心結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)。

技術(shù)特征：

1.降低所述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在下任一種中的應(yīng)用；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白來(lái)源于結(jié)球甘藍(lán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述降低所述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為下述任一種：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，b1)所述核酸分子的靶標(biāo)基因?yàn)樾蛄?2所示。

5.一種培育桔紅心甘藍(lán)的方法，其特征在于，所述方法包括降低目的甘藍(lán)中權(quán)利要求1-3中任一所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)量，得到桔紅心甘藍(lán)的步驟。

6.一種降低甘藍(lán)菜心明度的方法，其特征在于，所述方法包括降低目的甘藍(lán)中權(quán)利要求1-3中任一所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)量，得到低明度菜心甘藍(lán)，所述低明度菜心甘藍(lán)的菜心的明度低于所述目的甘藍(lán)。

7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述抑制或降低或下調(diào)甘藍(lán)中權(quán)利要求1-3中任一所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)包括向所述目的甘藍(lán)中導(dǎo)入權(quán)利要求3中b1)所述的核酸分子、b2)所述基因的表達(dá)盒、b3)所述的表達(dá)盒或b4)所述的重組載體。

8.一種培育桔紅心甘藍(lán)的方法，其特征在于，所述方法包括將甘藍(lán)基因組中序列22的第324位的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸殘基進(jìn)行缺失突變，獲得桔紅心甘藍(lán)。

9.如權(quán)利要求1-5任一所述的應(yīng)用或權(quán)利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述甘藍(lán)為結(jié)球甘藍(lán)。

10.如權(quán)利要求1-3任一所述應(yīng)用或權(quán)利要求5-9任一所述方法，其特征在于，所述桔紅心甘藍(lán)的結(jié)球期菜心為桔紅色，或，低明度菜心甘藍(lán)的結(jié)球期菜心的明度低于目的甘藍(lán)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及作物遺傳育種、作物新資源創(chuàng)新領(lǐng)域。公開(kāi)了結(jié)球甘藍(lán)突變型基因CRTISO?TP的創(chuàng)制及其在桔紅心結(jié)球甘藍(lán)育種中的應(yīng)用，具體的：A1)制備桔紅心甘藍(lán)和/或生產(chǎn)制備桔紅心甘藍(lán)產(chǎn)品中的應(yīng)用；A2)桔紅心甘藍(lán)育種和/或生產(chǎn)制備桔紅心甘藍(lán)育種產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述蛋白質(zhì)為如下任一種：B1)氨基酸序列是序列20所示的蛋白質(zhì)；B2)將B1)所述蛋白質(zhì)的經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與B1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；B3)將B1)或B2)的N末端或/和C末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。通過(guò)上述方法能夠獲得桔紅心甘藍(lán)，可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：陶鵬,李必元,岳智臣,趙彥婷,雷娟利,胡齊贊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24