本發(fā)明屬于生物工程，尤其是一種基于轉(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器、構(gòu)建和檢測(cè)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乳酸是一種由無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有l(wèi)型和d型兩種手性異構(gòu)體，是一種多功能的有機(jī)酸，在食品與飲料工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的用途。此外，乳酸的濃度可作為細(xì)胞代謝活性、健康狀態(tài)及生理功能變化的重要指標(biāo)，有助于理解生物體內(nèi)的代謝過(guò)程和病理機(jī)制。醋酸不僅是一種重要的化學(xué)原料和醫(yī)藥原料。而且可作為微生物代謝活動(dòng)和發(fā)酵產(chǎn)品安全和品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的重要標(biāo)志物之一，在發(fā)酵工程和食品科學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用意義。

2、目前酸性物質(zhì)的檢測(cè)方法主要為酶法、電化學(xué)法、高效液相色譜法(hplc)和離子色譜法(ic)等。其中，酶法和電化學(xué)法由于涉及純酶的制備、固定化和電極的使用，生產(chǎn)和維護(hù)的成本較高。此外，由于酶促反應(yīng)受到高濃度底物的抑制作用以及溫度和ph等環(huán)境因素的影響，方法的可靠性受到限制。色譜法雖然具有靈敏度和精確度高等優(yōu)點(diǎn)，但卻存在設(shè)備昂貴，步驟繁瑣、檢測(cè)通量小等問(wèn)題。

3、生物傳感器主要由識(shí)別元件和響應(yīng)元件兩個(gè)重要元件組成。當(dāng)待測(cè)物通過(guò)一定的滲透或流動(dòng)等作用進(jìn)入細(xì)胞后，通過(guò)分子識(shí)別作用與識(shí)別元件發(fā)生特異性結(jié)合，所產(chǎn)生的物理化學(xué)或生物信號(hào)可以通過(guò)響應(yīng)元件轉(zhuǎn)化為熒光和電等信號(hào)，從而對(duì)被測(cè)物進(jìn)行分析檢測(cè)。根據(jù)響應(yīng)機(jī)制的不同，生物傳感器主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)傳感器、核糖開(kāi)關(guān)傳感器和轉(zhuǎn)錄因子(tf)傳感器等?；谵D(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器是目前研究與應(yīng)用最廣泛的生物傳感器之一，其主要原理是轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與效應(yīng)物的特異性結(jié)合變得有活性，進(jìn)一步地結(jié)合或脫離其調(diào)控的下游啟動(dòng)子區(qū)，從而調(diào)控報(bào)告蛋白的表達(dá)水平以實(shí)現(xiàn)響應(yīng)特性并將目標(biāo)代謝物的濃度信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光等信號(hào)輸出。因此，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、通量高、速度快和可視化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥健康領(lǐng)域、發(fā)酵食品安全與質(zhì)量檢測(cè)、高產(chǎn)菌株的篩選、胞內(nèi)代謝途徑的動(dòng)態(tài)控制等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。目前，能夠分別檢測(cè)乳酸或醋酸等不同酸性物質(zhì)的生物傳感器還少見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種基于轉(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器、構(gòu)建和檢測(cè)方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種基于轉(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器，其特征在于：所述生物傳感器中含有啟動(dòng)子t7、與效應(yīng)物結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子rpir1、具有rpir1結(jié)合基序rpir?motif的下游啟動(dòng)子和位于啟動(dòng)子下游的報(bào)告蛋白；所述轉(zhuǎn)錄因子rpir1在效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化并與rpirmotif結(jié)合，增強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

4、進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)錄因子rpir1的編碼基因btw26_00630的序列與seq?id?no.1限定的dna序列至少具有70％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna序列；即序列編碼所得蛋白在效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化并與下游啟動(dòng)子中rpir?motif結(jié)合后增強(qiáng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

5、進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)錄因子rpir1與seq?id?no.2限定的氨基酸序列至少具有70％同源性且是與seq?id?no.2具有相同功能的衍生蛋白質(zhì)；即所述衍生蛋白質(zhì)在效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化并與下游啟動(dòng)子中rpir?motif結(jié)合后增強(qiáng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

6、進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)錄因子rpir1通過(guò)pcr后進(jìn)行電泳及回收或編碼基因合成的方法得到。

7、進(jìn)一步地，所述下游啟動(dòng)子需要含有轉(zhuǎn)錄因子rpir1結(jié)合基序rpir?motif且具有相同功能，即所述含有rpir?motif的下游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性在被效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化的轉(zhuǎn)錄因子rpir1結(jié)合后增強(qiáng)；其中rpir?motif的-35區(qū)序列為tgaa或ggaa，-10區(qū)序列為ttca或ttcc。

8、進(jìn)一步地，所述報(bào)告蛋白能夠發(fā)出并被檢測(cè)到熒光信號(hào)；

9、如上所述的生物傳感器的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

10、將t7啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子rpir1基因btw26_00630、具有rpir?motif的下游啟動(dòng)子和位于啟動(dòng)子下游的報(bào)告蛋白基因序列克隆至質(zhì)粒載體pet28a中組成表達(dá)載體，控制轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的t7啟動(dòng)子和控制報(bào)告蛋白mcherry表達(dá)的下游啟動(dòng)子方向相反。然后將測(cè)序驗(yàn)證正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，構(gòu)建全細(xì)胞生物傳感器。

11、如上所述的生物傳感器宿主細(xì)胞是大腸桿菌。

12、一種使用如上所述的生物傳感器檢測(cè)酸性物質(zhì)的方法，包括如下步驟：

13、(1)將含有不同濃度酸性物質(zhì)的樣品與所述生物傳感器共孵育，孵育完成后檢測(cè)報(bào)告蛋白熒光信號(hào)強(qiáng)度；

14、(2)建立報(bào)告基因與目標(biāo)物濃度的關(guān)系曲線；

15、(3)將樣品替換為待測(cè)樣品并重復(fù)(1)，帶入(2)的關(guān)系曲線中計(jì)算目標(biāo)物含量。

16、進(jìn)一步地，所述可被檢測(cè)的酸性物質(zhì)包括l-乳酸、d-乳酸、醋酸。

17、本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為：

18、1、本發(fā)明提供一種基于轉(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器。與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、通量高、速度快和可視化程度高等優(yōu)點(diǎn)。

19、2、本發(fā)明提供的一種基于轉(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器能夠分別對(duì)乳酸和醋酸等不同酸性物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴(lài)性。該傳感器在醫(yī)藥健康領(lǐng)域、發(fā)酵食品安全與質(zhì)量評(píng)估檢測(cè)、高產(chǎn)菌株的篩選、胞內(nèi)代謝途徑的動(dòng)態(tài)控制等方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

20、3、本發(fā)明提供的一種基于轉(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器能夠?qū)Σ煌瑯?gòu)型乳酸(d-乳酸和l-乳酸)以不同比例組成的混合物產(chǎn)生相似的響應(yīng)，說(shuō)明其在乳酸檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)出良好的廣譜性。

技術(shù)特征：

1.一種基于轉(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器，其特征在于：所述生物傳感器中含有啟動(dòng)子t7、與效應(yīng)物結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子rpir1、具有rpir1結(jié)合基序rpir?motif的下游啟動(dòng)子和位于啟動(dòng)子下游的報(bào)告蛋白；所述轉(zhuǎn)錄因子rpir1在效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化并與rpirmotif結(jié)合，增強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于：所述轉(zhuǎn)錄因子rpir1的編碼基因btw26_00630的序列與seq?id?no.1限定的dna序列至少具有70％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna序列；即序列編碼所得蛋白在效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化并與下游啟動(dòng)子中rpir?motif結(jié)合后增強(qiáng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于：所述轉(zhuǎn)錄因子rpir1與seq?id?no.2限定的氨基酸序列至少具有70％同源性且是與seq?id?no.2具有相同功能的衍生蛋白質(zhì)；即所述衍生蛋白質(zhì)在效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化并與下游啟動(dòng)子中rpirmotif結(jié)合后增強(qiáng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于：所述轉(zhuǎn)錄因子rpir1通過(guò)pcr后進(jìn)行電泳及回收或編碼基因合成的方法得到。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于：所述下游啟動(dòng)子需要含有轉(zhuǎn)錄因子rpir1結(jié)合基序rpir?motif且具有相同功能，即所述含有rpir?motif的下游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性在被效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化的轉(zhuǎn)錄因子rpir1結(jié)合后增強(qiáng)；其中rpir?motif的-35區(qū)序列為tgaa或ggaa，-10區(qū)序列為ttca或ttcc。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的生物傳感器，其特征在于：所述報(bào)告蛋白能夠發(fā)出并被檢測(cè)到熒光信號(hào)。

7.如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。

9.一種使用如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的生物傳感器檢測(cè)酸性物質(zhì)的方法，其特征在于：包括如下步驟：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述可被檢測(cè)的酸性物質(zhì)包括l-乳酸、d-乳酸、醋酸。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種基于轉(zhuǎn)錄因子的全細(xì)胞生物傳感器，所述生物傳感器中含有啟動(dòng)子T7、與效應(yīng)物結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子RpiR1、具有RpiR1蛋白結(jié)合基序RpiRmotif的下游啟動(dòng)子和位于啟動(dòng)子下游的報(bào)告蛋白；所述轉(zhuǎn)錄因子RpiR1在效應(yīng)物存在下發(fā)生構(gòu)象變化并與下游啟動(dòng)子中的RpiR?motif結(jié)合，增強(qiáng)啟動(dòng)子對(duì)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明生物傳感器能夠分別響應(yīng)乳酸和醋酸，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴(lài)性，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、通量高、速度快和可視化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥健康領(lǐng)域、發(fā)酵食品安全與質(zhì)量檢測(cè)、高產(chǎn)菌株的篩選、胞內(nèi)代謝途徑的動(dòng)態(tài)控制等方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：駱健美,王敏,胡錦超,劉志偉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28