本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法。

背景技術：

1、骨骼肌的肌質網控制著肌質游離鈣濃度，從而介導肌肉收縮和放松。鈣泵是維持細胞內外鈣離子濃度差異的重要蛋白質泵。serca是一種跨膜10次的陽離子轉運atp酶，其結構為四聚體，n2端和c2端都位于胞漿內，似球型結構，能主動把胞漿鈣泵入肌漿網內，也被稱為“鈣泵”。

2、serca1(鈣泵)主要存在于骨骼肌細胞中，位于骨骼肌細胞內的肌質網的膜上，調節(jié)肌質網內外鈣離子的濃度差異。當鈣離子被輸送出肌質網時，肌肉收縮；當鈣離子被輸送到肌質網時，肌肉就會放松。serca1將鈣離子從細胞質轉運到肌質網，引發(fā)肌肉松弛。由于細胞內膜系統(tǒng)及其各自的轉運活動，使用全肌肉細胞進行肌膜離子轉運的研究變得復雜。

3、如何將肌質網上的鈣泵分離純化出來，便于研究骨骼肌肌質網的鈣泵結構以及對鈣離子的轉運機制具有重要的生物學意義。

技術實現思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題是如何將肌質網上的鈣泵分離純化出來。

2、為了解決上述問題，本發(fā)明提出以下技術方案：

3、一種肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，包括以下步驟：

4、步驟一：取骨骼肌組織，去除結締組織，切成肉糜；

5、步驟二：將肉糜與裂解液混合并勻漿，得勻漿液；其中，肉糜與裂解液的質量體積比為0.1～2.0g:3ml；

6、步驟三：將勻漿液置于溫度為2～8℃、離心力為1,000～5,000g條件下離心10～30min，得到上清液s1；將上清液s1過濾后，將濾液置于溫度為2～8℃、離心力為10,000～30,000g條件下離心10～30min，得到上清液s2；將上清液s2過濾后，將濾液置于溫度為2～8℃、離心力為100,000～300,000g條件下離心30～90min，得到沉淀p3；

7、步驟四：將沉淀p3重懸于緩沖液中，得到重懸液r1；往超離管中依次加入0.8～1.8m的不連續(xù)密度的蔗糖溶液以及重懸液r1，于溫度為2～8℃、離心力為100,000～200,000g條件下離心1.5～3.0h；

8、步驟五：由上至下取出超離管內2/5～1/2體積的溶液，棄去，超離管內的剩余溶液經30～60kda截留量濃縮管濃縮后，采用凝膠排阻層析法進一步分離，洗脫組分在6.0～12.0ml之間為肌質網鈣泵囊泡。

9、其進一步的技術方案為，所述步驟二中，裂解液含有20～30mm?4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸ph?6.8～7.2，0.2～0.3m蔗糖，0.2～0.6mm二硫蘇糖醇。

10、其進一步的技術方案為，所述步驟一中，肉糜的體積小于2mm3。

11、其進一步的技術方案為，所述步驟三中，上清液s1用2～6層紗布過濾；上清液s2用2～6層紗布過濾。

12、其進一步的技術方案為，所述步驟四中，緩沖液含有20～30mm?4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸ph?6.8～7.2，0.5～0.8m氯化鉀，0.2～0.4m蔗糖，0.2～0.6mm二硫蘇糖醇。

13、其進一步的技術方案為，所述步驟四中，蔗糖溶液由蔗糖及緩沖溶液配制得到，所述緩沖溶液含有0.1～0.3m氯化鉀，4～6mm腺嘌呤核苷三磷酸，4～6mm氯化鎂，1～3mm氯化鈣，1～3mm乙二醇二乙醚二胺四乙酸，45～55mm磷酸鉀，ph?7.2～7.6。

14、其進一步的技術方案為，所述步驟四中，不連續(xù)密度的蔗糖溶液包括濃度為0.8m的蔗糖溶液，1.1m的蔗糖溶液，1.3m的蔗糖溶液，1.6m的蔗糖溶液。

15、其進一步的技術方案為，所述步驟四中，將沉淀p3重懸于緩沖液中，還包括進行勻漿及超聲破碎，得到重懸液r1。

16、其進一步的技術方案為，所述步驟五中，所述凝膠排阻層析法所用的層析柱為superose?610/300gl。

17、其進一步的技術方案為，所述步驟五中，所述凝膠排阻層析法所用的緩沖液含有15～25mm?4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸ph?7.2～7.5,90～110mm氯化鈉。

18、與現有技術相比，本發(fā)明所能達到的技術效果包括：

19、本發(fā)明提供的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，利用差速離心及不連續(xù)密度梯度離心的方法，結合了凝膠排阻層析，能夠從骨骼肌中準確分離純化得到肌質網鈣泵囊泡，且囊泡結構完整，形狀飽滿，輪廓清晰，大小均一。有利于高分辨率冷凍電子顯微鏡對肌質網鈣泵蛋白serca1的結構解析。對研究該酶催化atp水解以及鈣從細胞質轉移到肌質網腔，并參與肌肉興奮和收縮的機制奠定良好的基礎。

技術特征：

1.一種肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權利要求1所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟二中，裂解液含有20～30mm?4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸ph?6.8～7.2，0.2～0.3m蔗糖，0.2～0.6mm二硫蘇糖醇。

3.如權利要求1所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟一中，肉糜的體積小于2mm3。

4.如權利要求1所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟三中，上清液s1用2～6層紗布過濾；上清液s2用2～6層紗布過濾。

5.如權利要求1所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟四中，緩沖液含有20～30mm?4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸ph?6.8～7.2，0.5～0.8m氯化鉀，0.2～0.4m蔗糖，0.2～0.6mm二硫蘇糖醇。

6.如權利要求1所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟四中，所述蔗糖溶液由蔗糖及緩沖溶液配制得到，所述緩沖溶液含有0.1～0.3m氯化鉀，4～6mm腺嘌呤核苷三磷酸，4～6mm氯化鎂，1～3mm氯化鈣，1～3mm乙二醇二乙醚二胺四乙酸，45～55mm磷酸鉀，ph?7.2～7.6。

7.如權利要求6所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟四中，不連續(xù)密度的蔗糖溶液包括濃度為0.8m的蔗糖溶液，1.1m的蔗糖溶液，1.3m的蔗糖溶液，1.6m的蔗糖溶液。

8.如權利要求1所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟四中，將沉淀p3重懸于緩沖液中，還包括進行勻漿及超聲破碎，得到重懸液r1。

9.如權利要求1所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟五中，所述凝膠排阻層析法所用的層析柱為superose?610/300gl。

10.如權利要求1所述的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，其特征在于，所述步驟五中，所述凝膠排阻層析法所用的緩沖液含有15～25mm?4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸ph?7.2～7.5,90～110mm氯化鈉。

技術總結
本發(fā)明公開了一種肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，涉及生物技術領域。本發(fā)明提供的肌質網鈣泵囊泡的分離純化方法，依次將差速離心、蔗糖不連續(xù)密度梯度離心、凝膠排阻層析法進行結合，能夠從骨骼肌中準確分離純化得到肌質網鈣泵囊泡，且囊泡結構完整，形狀飽滿，輪廓清晰，大小均一。有利于高分辨率冷凍電子顯微鏡對肌質網鈣泵蛋白SERCA1的結構解析。對研究該酶催化ATP水解以及鈣從細胞質轉移到肌質網腔，并參與肌肉興奮和收縮的機制奠定良好的基礎。

技術研發(fā)人員：谷金科,吳博雯,張銘暉,周姿奕,梁周柱
受保護的技術使用者：深圳大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/4/24