本發明屬于植物培養和轉基因，尤其涉及一種白術毛狀根誘導方法與應用。

背景技術：

1、白術(atractylodes?macrocephala?koidz)為菊科蒼術屬多年生草本植物，以干燥根莖入藥，具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎的功效。主要用于治療脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲、眩悸、水腫、自汗、胎動不安等癥?，F代藥理研究表明，白術具有抗腫瘤、保護胃黏膜、抗氧化、抗炎、抑菌、調節糖脂代謝等。白術的主要化學成分包括揮發油，其中蒼術酮是主要的成分之一，含量可達60％-70％，與其他萜烯類等物質共同構成了白術的多種功效。白術的生產種植過程中連作障礙問題較為嚴重，種植過白術的土壤通常須間隔3～5年才能重新栽植白術，種植門檻高、種植面積減少、自然災害影響以及市場需求增加等原因導致白術資源逐年減少。

2、應用現代生物技術生產天然藥用成分可以有效緩解藥用植物資源壓力，并能為中藥的安全、有效、穩定、可控提供保障。毛狀根作為生物反應器具有生產周期短、易規模化、不受外界環境干擾且生理代謝活力強，遺傳穩定性好的特點，已被廣泛用于藥用植物離體培養與進行有效成分提取研究。此外，農桿菌介導的藥用植物毛狀根遺傳轉化和植株再生體系為研究中藥材基因功能和合成通路解析提供了重要平臺。目前毛狀根遺傳轉化已被應用到多種植物的培養過程中，但是白術本身培育難度較高，沒有現有技術給出以農桿菌介導的白術毛狀根誘導與培養的技術方案，另外，其遺傳轉化體系也仍需進一步的研究。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發明的目的在于提供一種白術毛狀根誘導方法與應用。

2、為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

3、本發明提供一種白術毛狀根誘導方法，包括如下步驟：

4、s1.將白術組培苗中的不定芽繼代培養20～25d后，用生根培養基培養5～9周得到白術生根苗；

5、s2.用農桿菌侵染液侵染白術生根苗后，培養得到侵染后的白術生根苗；

6、s3.將侵染后的白術生根苗新長出的毛狀根置于增殖培養基中，23～27℃避光培養；

7、所述農桿菌為k599農桿菌。

8、優選地，s1所述白術組培苗繼代培養的培養基為ms+6-ba?2.0～3.0mg/l+naa?0.3～0.8mg/l+蔗糖28～32g/l+瓊脂5～10g/l；所述生根培養基為ms+0.3-0.8mg/l?naa。

9、優選地，s2所述培養的條件為溫度23～27℃，光照時間11～13h/d，光照強度2000～3000lx。

10、優選地，所述農桿菌侵染液的制備方法包括以下步驟：

11、將農桿菌擴大培養至od600＝0.6～0.8，3000～5000rpm離心后用侵染液重懸，24-28℃避光靜置2-3h，即得農桿菌侵染液。

12、優選地，用yeb液體培養基培養農桿菌；

13、所述yeb液體培養基含有鏈霉素25～75μg/ml。

14、優選地，所述侵染液為在ms液體培養基中添加如下濃度的組分：8～12mm?mes，8～12mm?mgcl2，80～120μm乙酰丁香酮，ph＝5.8～6.0。

15、優選地，所述農桿菌侵染液的侵染方法為為直接于白術組培苗上制造傷口，將農桿菌侵染液覆蓋到已造成傷口的白術組培苗中；

16、所述使用農桿菌侵染液進行侵染的白術組培苗部位包括組培苗莖段或葉腋。

17、優選地，所述白術組培苗的每個部位使用注射器針頭制造4～7個傷口，每次使用的農桿菌侵染液量為3-8μl。

18、優選地，所述白術毛狀根增殖培養基為ms+蔗糖28～32g/l+瓊脂5～10g/l。

19、本發明提供所述白術毛狀根誘導方法在白術毛狀根誘導、遺傳轉化、基因功能研究和/或白術代謝產物生產中的應用。

20、與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

21、本發明提供了一種白術無菌體系的毛狀根誘導方法，通過優化農桿菌菌液的培養和稀釋、外植體的感染等步驟，成功培育出白術的毛狀根，為利用自主生長的白術毛狀根規模生產蒼術酮、白術內酯等活性成分奠定了基礎，解決了白術野生資源受限的問題。本發明的白術組培苗的培養方法能夠使白術快速生長、分化與生根，其毛狀根的誘導與培養具有取材方便，不受季節限制，培養時間短，遺傳穩定等優點，對白術轉基因技術的完善、為白術毛狀根的大量培養及利用、次生代謝物的合成與生產具有積極作用。

技術特征：

1.一種白術毛狀根誘導方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據權利要求1所述的白術毛狀根誘導方法，其特征在于，s1所述白術組培苗繼代培養的培養基為ms+6-ba?2.0～3.0mg/l+naa?0.3～0.8mg/l+蔗糖28～32g/l+瓊脂5～10g/l；所述生根培養基為ms+0.3-0.8mg/l?naa。

3.根據權利要求1所述的白術毛狀根誘導方法，其特征在于，s2所述培養的條件為溫度23～27℃，光照時間11～13h/d，光照強度2000～3000lx。

4.根據權利要求1所述的白術毛狀根誘導方法，其特征在于，所述農桿菌侵染液的制備方法包括以下步驟：

5.根據權利要求4所述的白術毛狀根誘導方法，其特征在于，用yeb液體培養基培養農桿菌；

6.根據權利要求4所述的白術毛狀根誘導方法，其特征在于，所述侵染液為在ms液體培養基中添加如下濃度的組分：8～12mm?mes，8～12mm?mgcl2，80～120μm乙酰丁香酮，將ph調至5.8～6.0。

7.根據權利要求1所述的白術毛狀根誘導方法，其特征在于，所述農桿菌侵染液的侵染方法為直接于白術組培苗上制造傷口，將農桿菌侵染液覆蓋到已造成傷口的白術組培苗中；

8.根據權利要求7所述的白術毛狀根誘導方法，其特征在于，所述白術組培苗的每個部位侵染4～7次，每次使用的農桿菌侵染液量為3-8μl。

9.根據權利要求1所述的白術毛狀根誘導方法，其特征在于，所述增殖培養基為ms+蔗糖28～32g/l+瓊脂5～10g/l。

10.權利要求1所述白術毛狀根誘導方法在白術毛狀根誘導、遺傳轉化、基因功能研究和/或白術代謝產物生產中的應用。

技術總結
本發明提供了一種白術毛狀根誘導方法與應用，屬于植物培養和轉基因技術領域，通過優化農桿菌菌液的培養和稀釋、外植體的感染等步驟，成功培育出白術的毛狀根，為利用自主生長的白術毛狀根規模生產蒼術酮、白術內酯等活性成分奠定了基礎，解決了白術野生資源受限的問題。本發明白術毛狀根的誘導和培養方法，具有激素自主性快速生長、分化，增殖系數高，遺傳穩定，取材方便，不受季節限制，培養時間短等優點，對于白術轉基因技術的完善，為白術毛狀根的大量培養及利用后期白術毛狀根的次生產物的生物轉化具有積極作用。

技術研發人員：郭蘭萍,馮鈴芳,王升,張逸風,張成才,代曉雨
受保護的技術使用者：中國中醫科學院中藥研究所
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24