本發明屬于生物醫藥檢測，具體涉及一種利用蛋白a免疫吸附廢液制備人hla特異性抗體檢測標準品的方法。

背景技術：

1、人類白細胞抗原（hla）是主要組織相容性復合體（mhc）的組成部分，是重要的免疫分子。hla分子位于細胞膜上，參與機體的免疫反應，包括抗原呈遞、免疫監視和免疫耐受等重要生理功能。hla抗體是由免疫系統對異體hla分子產生的特異性免疫反應產物，它們能夠引發排斥反應，導致移植器官的損傷，影響移植的長期存活率。在進行腎移植前，hla抗體的檢測尤為重要。由于hla抗體的存在可能導致移植物急性排斥反應或長期慢性排斥，因此在移植前后對受者體內hla抗體進行檢測，可以幫助評估移植失敗的風險。

2、目前，hla抗體的檢測方法主要包括細胞學方法、酶聯免疫吸附法（elisa）、流式細胞術和單分子免疫分析等。盡管這些方法能夠檢測到hla抗體的存在，但由于不同檢測方法之間的差異，標準化的問題一直困擾著臨床診斷。特別是在標準品方面，目前常見的hla抗體標準品依賴于人體血清或異體組織提取，其穩定性較差，且來源有限。因此，開發高質量、穩定且標準化的hla抗體檢測標準品，成為提升hla抗體檢測準確性、提高移植成功率的一個重要任務。hla抗體檢測標準品的缺點主要體現在以下幾個方面：1、來源有限：現有的hla抗體標準品大多來源于人體血清，或通過動物模型制備，這些標準品的獲取過程復雜且數量有限，不能滿足大規模臨床檢測的需求。2、穩定性差：hla抗體標準品的穩定性較差，尤其在長期保存時，可能出現抗體降解或活性降低的情況，這直接影響了檢測結果的準確性。3、缺乏特異性表位標準品：不同實驗室和檢測方法之間由于標準品的來源差異、例如多克隆血清或動物來源多克隆抗體，導致檢測結果存在差異，影響了hla抗體檢測的廣泛應用。

3、蛋白a吸附法是目前廣泛應用于分離和純化抗體的技術之一。蛋白a是來源于細菌的一種表面蛋白，能夠特異性地與igg抗體結合，廣泛用于抗體的分離、純化和免疫治療。由于其高效的結合能力，蛋白a吸附法被廣泛應用于單克隆抗體的生產、免疫治療和血漿治療等領域。在腎移植治療中，蛋白a吸附被用于去除機體內不良的免疫反應抗體，從而減少排斥反應，提高移植的成功率。在實際應用中，蛋白a吸附過程中產生的廢液往往含有大量的免疫球蛋白，包括hla抗體。這些廢液通常會被廢棄或進行簡單處理。然而，廢液中往往蘊含著潛在的資源——hla抗體。這些抗體如果能夠有效回收，將極大提升其資源利用率，甚至為hla抗體的檢測標準品生產提供原材料。開發高效的廢液回收工藝，不僅能夠提高經濟效益，還可以有效減少環境污染，并為相關領域的研究提供新的材料來源。因此，hla特異性抗體的吸附需要hla蛋白進行吸附。

4、hla蛋白特異性吸附技術通過利用特異性吸附劑從生物樣品中選擇性地提取與hla分子相關的抗體，為hla抗體的純化和檢測提供了更高的效率和準確性。這一技術不僅能提高hla抗體的檢測靈敏度，還能夠保證抗體的穩定性，為hla抗體標準品的生產提供了可靠的來源，進一步推動了hla抗體檢測技術的標準化和精準化。例如，在腎移植、心臟移植等器官移植手術中，準確檢測移植受者體內的hla抗體可以幫助評估排斥風險，并為移植前后的免疫治療提供參考。在《靶向包含非典型hla-i和新抗原的復合物的抗體及其使用方法》（申請號：cn202180057675.8）提供了選擇性結合hla-e等非典型hla-i及新抗原的抗體。這類抗體具有很高的特異性，能夠幫助篩選與免疫逃逸相關的抗原，為免疫治療提供了更為精準的治療工具，特別是在癌癥免疫治療和免疫監測中具有重要應用價值。

技術實現思路

1、基于以上現有技術，本發明的首要目的在于提供一種利用蛋白a免疫吸附廢液制備人hla特異性抗體檢測標準品的方法。

2、本發明的另一目的在于提供一種通過上述方法制備得到的人hla特異性抗體檢測標準品。

3、本發明目的通過以下技術方案實現：

4、一種利用蛋白a免疫吸附廢液制備人hla特異性抗體檢測標準品的方法，包括如下步驟：

5、（1）將蛋白a免疫吸附廢液采用tris-hcl緩沖液進行中和，將ph調整至6.9~7.2，并添加蛋白保護劑，保持igg活性；

6、（2）將步驟（1）所得溶液采用蛋白g親和層析去除非igg雜蛋白，得到富集液；

7、（3）將步驟（2）所得富集液通過納米過濾清除病毒，然后采用hla-特異性吸附柱進行表位特異性富集，得到hla特異性抗體檢測標準品。

8、進一步地，步驟（1）中所述蛋白a免疫吸附廢液來自于接受hla相關治療或移植術后患者的血液經蛋白a免疫吸附柱吸附處理后的洗脫液。

9、進一步地，步驟（1）中所述tris-hcl緩沖液采用濃度為1?m，ph值為9.0~9.3的tris-hcl緩沖液。

10、進一步地，步驟（1）中所述蛋白保護劑及添加量為5?wt%d-海藻糖+2?wt%甘露醇。

11、進一步地，步驟（3）中所述納米過濾清除病毒采用孔徑為35~45?nm的膜進行納米過濾，過濾壓力為0.2?mpa。

12、進一步地，步驟（3）中所述hla-特異性吸附柱通過如下方法制備：

13、將hla蛋白與交聯瓊脂糖微珠（如thermo?amino?link?plus偶聯樹脂）分散液進行混合反應孵育，再用氨基試劑封閉多余的活化位點，得到偶聯hla蛋白的微珠，將其裝入吸附柱，即得到hla-特異性吸附柱。

14、進一步優選地，所述交聯瓊脂糖微珠分散液的質量濃度為4?wt%；所述hla蛋白與交聯瓊脂糖微珠分散液混合的質量體積比為2:3（mg/ml）。

15、進一步優選地，所述混合反應孵育的溫度為37℃，ph為7.2~7.4，時間為1?h。

16、進一步優選地，所述氨基試劑采用ph值為7.2~7.4的tris-hcl溶液。

17、進一步地，步驟（3）中所述表位特異性富集的步驟如下：

18、將清除病毒的富集液注入hla-特異性吸附柱中進行吸附，吸附完成后用tris-nacl平衡緩沖液沖洗吸附柱，再用tris-甘氨酸緩沖液洗脫吸附的特異性抗體，將洗脫液用tris-nacl溶液中和至中性，對所得產物進行蛋白定量和抗體結合表位鑒定，得到hla特異性抗體檢測標準品。

19、進一步地，步驟（3）中所得hla特異性抗體檢測標準品進一步通過如下方法制備成凍干制劑：

20、將hla特異性抗體檢測標準品溶解在凍干保護劑中，過濾除菌后冷凍干燥，充入惰性氣體密封保存，得到hla特異性抗體檢測標準品凍干制劑。

21、進一步優選地，所述凍干保護劑成分組成為：0.1?m檸檬酸鹽緩沖液（ph?6.5），0.01?wt%?tween-80，0.1?wt%?bsa，5?wt%海藻糖。

22、進一步優選地，所述冷凍干燥程序為：先在-40至-80℃預凍，使溶液完全凝固，然后抽真空至10~50?mtorr，升溫至-40至-10℃升華去除大部分水分，再升溫至20至30℃去除殘余水分。

23、一種hla特異性抗體檢測標準品或凍干制劑，通過上述方法制備得到。

24、本發明原理為：蛋白a免疫吸附柱洗脫液來源于接受hla相關治療或移植術后患者的血液，可能包含hla多基因、多克隆、多表位抗體以及其他復雜成分。廢液中的主要成分包括：

25、（1）igg抗體：igg1、igg3是hla抗體標準品的核心成分，igg2、igg4、自身抗體（如ana、rf等）等可能導致假陽性，影響hla抗體檢測的準確性。

26、（2）雜蛋白：fc結合蛋白、補體蛋白、血漿蛋白等可能干擾抗體純化，需要去除。

27、（3）病毒污染物：如hbv、hcv、hiv、hav等，需要有效去除以確保產品的生物安全性。

28、（4）內毒素：殘留內毒素可能影響產品的安全性，需要控制在低于0.5eu/ml。

29、通過依次的中和保護處理（由于蛋白a洗脫一般采用低ph（2.5-3.5）的緩沖液（如0.1m乙酸），直接回收可能導致igg部分變性、抗原結合能力下降。本發明采用tris-hcl緩沖液進行快速中和，將洗脫液ph調整至6.9-7.2，并添加d-海藻糖和甘露醇作為蛋白保護劑，保持igg活性）、蛋白g親和層析去除雜蛋白（利用蛋白g對hla特異性抗體具有較強親和力，用于去除非igg雜蛋白，提高hla抗體富集度）、納米過濾清除病毒的預處理步驟，使廢液符合hla抗體標準品質量要求。最后通過hla-特異性吸附柱進行表位特異性富集，得到可以靶向hla抗原特點表位的抗體檢測標準品。

30、與現有技術相比，本發明的有益效果是：

31、（1）原料創新：利用蛋白a免疫吸附柱處理后產生的洗脫液作為基礎原料，降低成本且真實反映患者hla抗體特異性。

32、（2）工藝創新：采用依次的中和保護處理、蛋白g親和層析去除雜蛋白、納米過濾清除病毒、表位特異性富集以及凍干穩定性修飾等多重工序，確保制品均一性和穩定性。