本技術(shù)涉及微生物發(fā)酵培養(yǎng)及利用微生物進(jìn)行膠原蛋白水解的，具體涉及一種側(cè)孢短芽孢桿菌及其水解膠原蛋白獲得膠原蛋白肽的方法。

背景技術(shù)：

1、側(cè)孢短芽孢桿菌是一類菌體呈桿狀、周生鞭毛的兼性厭氧菌，也是通常用作生物防治的益生菌。側(cè)孢短芽孢桿菌的用途非常廣泛，包括：在畜牧業(yè)中，可被用作動(dòng)物飼料中的微生物添加劑。在農(nóng)業(yè)上，其作為微生物肥料還能有效改善土壤肥力,促進(jìn)作物生長。在漁業(yè)上，側(cè)孢短芽孢桿菌能抑制藻類細(xì)胞光合作用，使其難以維持生存，并引起藻類細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，使藻類死亡，從而達(dá)到水質(zhì)調(diào)控和藍(lán)藻控制的效果，有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖。在食品領(lǐng)域，其產(chǎn)生的抗菌肽具有廣譜的抑菌活性，耐高溫，耐酸堿且對蛋白水解酶敏感，進(jìn)而可應(yīng)用于食品防腐保鮮。

2、膠原蛋白是一種由三條肽鏈擰成的三螺旋形纖維狀蛋白質(zhì)，它屬于纖維狀蛋白質(zhì)中的不溶性蛋白，是很多脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)。膠原蛋白具有良好的低免疫性、生物相容性和可降解性，可以廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。膠原蛋白肽(也稱膠原多肽)是由膠原蛋白水解后形成的相對分子量較小的產(chǎn)物，相比于膠原蛋白，膠原蛋白肽的吸收利用率更高，效果更好，且可以促進(jìn)食品中的其它蛋白質(zhì)的吸收。膠原多肽可完全溶解于水(冷水亦可溶解)，還具有一定的抗高血壓和血管緊張素(ace)抑制活性，改善皮膚及愈合傷口、抑菌、抗氧化活性、促進(jìn)骨合成作用等，因此，膠原多肽在食品(包含保健品)、醫(yī)療、美容護(hù)膚等行業(yè)有不可替代的重要作用，且需求日益增加。

3、目前，膠原蛋白的提取主要采用動(dòng)物皮提取，方法包括堿提取法、酸提取法、熱水浸提法、酶解提取法和復(fù)合法。單獨(dú)酸法或酶-酸聯(lián)合法的提取均容易破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，堿法提取會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生消旋現(xiàn)象。熱水浸提法提取膠原蛋白的方法會(huì)導(dǎo)致膠原組織分解不徹底，膠原蛋白得率較低。酶解提取法相對于其他方法而言，較為溫和且效率更高，產(chǎn)物的活性保留程度更好。現(xiàn)有技術(shù)中，如授權(quán)號為cn113943770b的專利申請中，其采用酸+酶結(jié)合+鹽析的方法提取魚皮膠原蛋白，工藝復(fù)雜且采用商業(yè)化酶，成本高。在公開號為cn110922475a的專利申請中，其采用兩種以上的聯(lián)合酶從豬皮提取膠原蛋白，包括“胃蛋白酶處理時(shí)，ph為2～3，溫度為30～40℃；木瓜蛋白酶處理時(shí)，ph為6～7，溫度為50～60℃；胰蛋白酶處理時(shí)，ph為7～8，溫度為40～50℃”，現(xiàn)有的方法中，對于酶的選擇均采用的商業(yè)化酶，然而，商業(yè)化酶成本高，且反應(yīng)條件更是以酶活的最適條件為準(zhǔn)，因此，商業(yè)化酶的使用使整個(gè)膠原蛋白的提取過程成本高且工藝繁雜。

4、從膠原蛋白進(jìn)一步水解獲得膠原蛋白肽的方法目前主要有合成法和分解法兩種。有學(xué)者就曾使用合成法來制作牛骨膠原蛋白肽，但該方法需要先確定牛骨膠原蛋白肽序列，門檻較高，分解法則相對容易。分解法常用酶解，包括胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、動(dòng)物復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶。同理，在降解下分子膠原蛋白肽過程中，目前的主流方法也是直接采用商業(yè)化酶進(jìn)行，如前所述，這些成熟的商業(yè)酶不僅價(jià)格非常昂貴，而且降解條件苛刻(需要在酶活最優(yōu)的反應(yīng)條件下進(jìn)行降解才能效果最佳也不至于浪費(fèi)酶，因此對于溫度、底物濃度等要求均比較多)，而且用量大，無疑增加了企業(yè)的生產(chǎn)成本。

5、因此，如何開發(fā)一種可天然產(chǎn)蛋白水解酶的菌來替換上述價(jià)格昂貴、用量大的商業(yè)酶，直接通過簡單的發(fā)酵+自產(chǎn)酶工藝聯(lián)合起來，采用該工藝來提取膠原蛋白和/或獲得膠原蛋白肽，降低提取成本，簡化提取工藝，降低對設(shè)備的要求，以及對環(huán)境的污染，這對于企業(yè)規(guī)模化進(jìn)行膠原蛋白/膠原蛋白肽的制備和廣泛應(yīng)用至關(guān)重要，也是實(shí)現(xiàn)更高資源化利用發(fā)酵過程產(chǎn)物的新方法，為發(fā)酵企業(yè)環(huán)保、產(chǎn)物處理等提供了新的借鑒和思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述諸多企業(yè)生產(chǎn)過程中的實(shí)際技術(shù)問題，本發(fā)明開發(fā)了一種全新的側(cè)孢短芽孢桿菌，進(jìn)而獲得了采用該側(cè)孢短芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物來直接提取膠原蛋白/獲得膠原蛋白肽的方法。具體技術(shù)方案如下：

2、一種側(cè)孢短芽孢桿菌，其名稱為：側(cè)孢短芽孢桿菌(brevibacilluslaterosporus)scut-br-2，于2024年10月15日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址為：廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，保藏編號為：gdmcc?no.65271。

3、作為對上述方案的進(jìn)一步限定，所述的側(cè)孢短芽孢桿菌從肉制品中分離培養(yǎng)并純化得到。

4、作為對上述方案的進(jìn)一步限定，所述的側(cè)孢短芽孢桿菌采用的培養(yǎng)基包括：lb培養(yǎng)基，培養(yǎng)基a，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

5、作為對上述方案的進(jìn)一步限定，所述培養(yǎng)基a配方為：膠原蛋白粉末0.8％，牛肉膏0.1％，葡萄糖0.1％，kh2po4?0.05％，mgso4·7h2o?0.01％，瓊脂2％，調(diào)培養(yǎng)基a的ph至7.0。

6、作為對上述方案的進(jìn)一步限定，所述的側(cè)孢短芽孢桿菌從肉制品中分離培養(yǎng)并純化的步驟包括：將肉制品研磨，稱取1g加入到裝有49ml無菌生理鹽水于三角瓶中，充分搖動(dòng)30min，靜置，取中層清夜作為菌懸液并進(jìn)行梯度稀釋。采用平板稀釋分離法把梯度稀釋后的菌懸液分別涂布到lb瓊脂固體培養(yǎng)基上，在30-40℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出單菌落，選取單菌落分別挑在篩選培養(yǎng)基a平板上，于30-40℃倒置培養(yǎng)1～2d；根據(jù)篩選特征，篩選挑取正常生長且菌落形態(tài)性狀差異明顯的單菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上反復(fù)平板劃線進(jìn)行純培養(yǎng)，編號后保存?zhèn)溆谩?/p>

7、本發(fā)明還申請保護(hù)一種采用上述側(cè)孢短芽孢桿菌(brevibacilluslaterosporus)scut-br-2對牛骨膠原蛋白進(jìn)行酶解的方法，包括：配置12.5％的牛骨膠原蛋白溶液，于50℃攪拌溶解，加入0.3％(以牛骨膠原蛋白質(zhì)量為基準(zhǔn))的膠原蛋白酶粗提液，于50℃反應(yīng)8-24h，然后于反應(yīng)液中加入0.5％-3％活性炭粉(以牛骨膠原蛋白質(zhì)量為基準(zhǔn))，吸附除味1h，先用雙圈定性快速濾紙過濾一次，再用0.45μm的微孔濾膜過濾一次，得到澄清透明濾液；將濾液于70℃加熱5min，使酶滅活，收集濾液進(jìn)行噴霧干燥，獲得牛骨膠原蛋白肽。

8、作為對上述方案的進(jìn)一步限定，所獲得的牛骨膠原蛋白肽滿足如下各性能至少之一：

9、(1)牛骨膠原蛋白肽對dpph自由基的清除率為10.53±0.47％；

10、(2)對彈性蛋白酶的抑制率為14.39±0.52％；

11、(3)對透明質(zhì)酸酶的抑制率為47.02±2.49％；

12、(4)牛骨膠原蛋白肽的重均分子量為1870g/mol。

13、作為對上述方案的進(jìn)一步限定，所述膠原蛋白酶粗提液通過如下方法獲得：從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上挑取一定量的側(cè)孢短芽孢桿菌scut-br-2菌落，加入菌體質(zhì)量1.5倍的無菌水，搖勻，在4℃，8000rmp下離心10min，所得上清液即為本發(fā)明所采用的膠原蛋白酶粗提液。

14、作為對上述方案的進(jìn)一步限定，所獲牛骨膠原蛋白肽的產(chǎn)率為42.48％。

15、本技術(shù)還要求保護(hù)一種采用上述側(cè)孢短芽孢桿菌(brevibacilluslaterosporus)scut-br-2在魚皮、豬皮、牛皮、驢皮膠原蛋白提取中的應(yīng)用。

16、有益的技術(shù)效果

17、本發(fā)明提供的側(cè)孢短芽孢桿菌(b.laterosporus)scut-br-2在魚皮等動(dòng)物皮的膠原蛋白提取過程中作用效果良好。同時(shí)，在采用牛骨膠原作為原料時(shí)，其分解膠原蛋白成為小分子肽效果顯著；具體表現(xiàn)在，所獲得的牛骨膠原蛋白肽對dpph自由基的清除率為10.53±0.47％，對彈性蛋白酶的抑制率為14.39±0.52％，對透明質(zhì)酸酶的抑制率為47.02±2.49％，分別表明了牛骨膠原蛋白肽有一定的抗氧化作用、抗皺緊致效果、舒緩保濕效果，能夠很好的應(yīng)用于各類護(hù)膚品、美容液等中。本發(fā)明提供的側(cè)孢短芽孢桿菌scut-br-2提取的酶非常適合在中性條件下進(jìn)行膠原蛋白的提取和處理，避免額外添加的如胃蛋白酶或堿性蛋白酶等商品酶需要額外添加酸堿試劑進(jìn)行調(diào)酸調(diào)堿而容易引入無機(jī)離子雜質(zhì)；此外，本發(fā)明直接采用側(cè)孢短芽孢桿菌(b.laterosporus)scut-br-2的粗提發(fā)酵提取液，即本發(fā)明所采用的膠原蛋白粗提液進(jìn)行膠原蛋白的提取，和牛骨膠原蛋白肽的處理，不僅省略了酶的純化等步驟，而且，還綜合利用了粗提液中除了側(cè)孢短芽孢桿菌(b.laterosporus)scut-br-2自身所產(chǎn)的胞外膠原蛋白酶之外的其他促進(jìn)酶解的有益成分，如側(cè)孢短芽孢桿菌(b.laterosporus)scut-br-2在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的細(xì)胞外分泌物等，這些成分的存在，能給粗提液中的膠原蛋白酶提供一定的活力和養(yǎng)分，對酶的活性具備促進(jìn)作用，促使該酶的酶解更加高效。細(xì)胞外分泌物對細(xì)胞外酶活性的促進(jìn)主要體現(xiàn)在：增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。某些細(xì)胞外分泌物能夠給酶提供相對穩(wěn)定和熟悉的生存工作環(huán)境，從而提高酶的穩(wěn)定性和活性。其次是，粗體液中的細(xì)胞外分泌物本身就給酶的活性保持提供了熟悉的底物，促進(jìn)酶的反應(yīng)速率。申請人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中所提供的側(cè)孢短芽孢桿菌scut-br-2通過分泌特定的多糖或蛋白質(zhì)，能提高其細(xì)胞外酶對底物的降解效率。此外，粗提液中的菌的細(xì)胞外分泌物中的不同成分還會(huì)相互作用，增強(qiáng)酶的催化效果。本發(fā)明中，側(cè)孢短芽孢桿菌scut-br-2分泌的小分子可以激活酶的活性或提高其底物的可接觸性，從而加速了酶解的反應(yīng)速率。從處理成本來看，本發(fā)明提供的側(cè)孢短芽孢桿菌scut-br-2的培養(yǎng)條件比市面商品酶更加簡單，容易保存，而且成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景；而酶的粗提液省略了提純分離等一系列繁瑣步驟，即簡化了整個(gè)工藝流程，又綜合利用了粗提液中的各成分，大大降低了生產(chǎn)成本，并節(jié)約了資源，減少生產(chǎn)過程中廢水帶來的環(huán)境污染或處理廢水的流程和成本等。同時(shí)，本發(fā)明提供的側(cè)孢短芽孢桿菌scut-br-2及其粗提液在解決環(huán)境污染問題以及資源浪費(fèi)問題中也具有重要的應(yīng)用潛力。通過應(yīng)用其在動(dòng)物皮上提取膠原蛋白，可以綜合資源化利用動(dòng)物皮并獲得高價(jià)值產(chǎn)物，為生物技術(shù)的應(yīng)用提供可持續(xù)發(fā)展的解決方案，推動(dòng)生物技術(shù)的綠色發(fā)展。