本發(fā)明涉及縮醛磷脂的，尤其是涉及一種酰胺類縮醛磷脂化合物的制備方法及應用。

背景技術(shù)：

1、縮醛磷脂是一類特殊的磷脂代表，約占細胞總磷脂的10%，它是一種含有烯醚鍵的甘油磷脂，如縮醛磷脂酰乙醇胺、縮醛磷脂酰膽堿、縮醛磷脂酰絲氨酸等。主要特征是在sn-1位置含有烯醚鍵，及在哺乳動物中通常連接著c16:0;18:0或18:1的脂肪醇，在sn-2上多是n-3和n-6的多不飽和脂肪酸。縮醛磷脂大多數(shù)集中分布在生物膜“脂筏”結(jié)構(gòu)中，參與細胞融合、離子轉(zhuǎn)運及膽固醇的運輸，在大腦、心臟等器官中含量豐富，同時也可以作為質(zhì)膜上重要抗氧化劑，避免神經(jīng)細胞的損傷。

2、目前很多研究的結(jié)果都顯示縮醛磷脂含量的下降與許多疾病有關(guān)，例如：阿爾茲海默癥、帕金森病、zellweger綜合癥等。其中，阿爾茨海默癥（ad）是一種進行性神經(jīng)退行性疾病，是最常見的癡呆癥，阿爾茲海默癥的嚴重程度和縮醛磷脂的減少程度存在正相關(guān)的關(guān)系，很多動物實驗和臨床實驗也證實了縮醛磷脂可以提高輕度認知障礙、輕度阿爾茲海默癥患者和小鼠模型的學習能力和記憶力。

3、縮醛磷脂是通過化學合成或從動物組織中提取的方法獲得的，例如，公開號為cn110621683b的發(fā)明專利公開了環(huán)狀縮醛磷脂酰乙醇胺及其化學合成方法，但由于化學合成過程中需要大量的化學物質(zhì)以及產(chǎn)生潛在的危險廢物，限制了化學合成方法的應用。縮醛磷脂還可從海洋動物或動物組織中制備，并且迄今為止，大多數(shù)還是依靠富含血漿激素的生物體提取脂類，但這些天然材料中的縮醛磷脂含量非常低，僅占所用組織細胞膜磷脂的10%以下，進而限制其廣泛應用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種酰胺類縮醛磷脂化合物的制備方法及應用，通過采用純化后的重組粘細菌carf蛋白以及化學合成carf蛋白反應的底物（化合物4），利用具有脂肪酸鏈的烷基磷脂酰乙醇胺生成相對應的縮醛磷脂酰乙醇胺，最終合成了一種酰胺類縮醛磷脂，能夠顯示出與天然縮醛磷脂的相近效果。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種酰胺類縮醛磷脂化合物的制備方法，包括如下步驟：

4、（1）將化合物1和化合物2在hepes緩沖液中反應，得到化合物3；

5、（2）將化合物3利用磷脂酶d在乙酸乙酯相和水相中、ca2+離子的輔助下進行反應，得到化合物4；

6、（3）來源于粘細菌的carf蛋白的表達和純化；

7、（4）將化合物4和carf蛋白在tris-hcl緩沖液中、nadh和過氧化氫酶的輔助下進行反應，得到化合物5；

8、化合物1-5的結(jié)構(gòu)式如下：

9、。

10、?其中，化合物1為dodecanoyl-amp?；

11、化合物2為1-o-hexadecyl-2-(β-ala)-sn-glycero-3-phosphocholine，c27h8n2o7p,[m+h]+；

12、化合物3為1-o-hexadecyl-2-[β-ala-(dodecanoyl)]-sn-glycero-3-phosphocholine，c39h79n2o8pna,[m+na]+；

13、化合物4為1-o-hexadecyl-2-[β-ala-(dodecanoyl)]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，c36h73n2o8pna,[m+na]+；

14、化合物5為1-(1-hexadecenyl)-2-[β-ala-(dodecanoyl)]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，c36h71n2o8pna,[m+na]+。

15、作為優(yōu)選，化合物1的制備方法包括如下步驟：將5’-amp溶解在氫氧化鈉、吡啶和水的混合溶液中，得到5’-amp溶液；再將含十二酸酐的四氫呋喃溶液加入5’-amp溶液中，攪拌反應，反應后進行提取后處理，得到化合物1。

16、?作為優(yōu)選，所述吡啶和水的體積比為1:1；所述混合溶液中氫氧化鈉的濃度為0.4-0.6mm；所述5’-amp溶液中5’-amp的濃度為17-19?mg/ml；所述含十二酸酐的四氫呋喃溶液中十二酸酐的濃度為30-50?mg/ml；所述含十二酸酐的四氫呋喃溶液和5’-amp溶液的體積比為1:1；所述攪拌反應為在室溫下攪拌20-30min。

17、作為優(yōu)選，化合物2的制備方法包括如下步驟：將1-o-十六烷基-sn-甘油基-3-膽堿磷酸、bco-β-丙氨酸、4-二甲基氨基吡啶和三乙胺加入氯仿中，然后加入2，4，6-三氯苯甲酰氯攪拌反應，加水除去溶劑后得到固體；將固體和三氟乙酸在二氯甲烷中再次攪拌反應，除去溶劑后，得到化合物2。

18、作為優(yōu)選，所述1-o-十六烷基-sn-甘油基-3-膽堿磷酸、bco-β-丙氨酸、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺和氯仿的摩爾比為9-11：23-26：55-65：0.5-2：450；所述2，4，6-三氯苯甲酰氯和1-o-十六烷基-sn-甘油基-3-膽堿磷酸的摩爾比為1:1；所述攪拌反應的時間為12-15h；所述固體和混合溶液的加入量之比為150-200mg：5ml；所述再次攪拌反應的時間為20-30min。

19、?作為優(yōu)選，步驟（1）中，所述化合物1和化合物2的摩爾比為1：0.8-1.3；所述反應的條件為ph?7-8，37℃，攪拌反應3-5h。

20、作為優(yōu)選，步驟（2）具體包括如下步驟：將化合物3溶解于乙酸乙酯中，得到乙酸乙酯相；將磷脂酶d和乙醇胺加入水中，得到水相；將乙酸乙酯相和水相混合，并加入cacl2反應，反應完成后，取乙酸乙酯相進行干燥，得到化合物4。

21、?作為優(yōu)選，所述乙酸乙酯相中化合物3的濃度為2-4?mg/ml；所述水相中磷脂酶d的濃度為3-10?mg/ml；所述磷脂酶d和乙醇胺的質(zhì)量比為1：5-10；所述乙酸乙酯相和水相的體積比為1.5-3：1；所述cacl2的加入量為使得加入后溶液中cacl2的濃度為3-10?mm；所述反應為在30-40℃下攪拌反應7-8h。

22、作為優(yōu)選，步驟（3）中，carf蛋白的表達包括如下步驟：培養(yǎng)粘細菌和枯草芽孢桿菌，提取基因組，進行carf和mistic目的基因擴增。質(zhì)粒pet28a、carf和mistic在重組酶作用下，獲得pet28a-mistic-carf重組質(zhì)粒。pet28a-mistic-carf重組質(zhì)粒在大腸桿菌overexpreessc43(de3)細胞中進行mistic-carf共同表達。

23、作為優(yōu)選，步驟（3）中，carf蛋白的純化包括如下步驟：將mistic分子伴侶和carf蛋白通過ni2+進行切割、純化得到carf蛋白。

24、作為優(yōu)選，步驟（4）中，所述化合物4和carf蛋白的加入質(zhì)量之比為1：100-1000；所述化合物4和nadh的摩爾比為1：1-5；所述化合物4和過氧化氫酶的加入質(zhì)量之比為100:1-10；所述tris-hcl緩沖液的ph為7-7.5；所述反應的溫度為30-37℃，時間為16-24h。

25、第二方面，本發(fā)明還提供了一種酰胺類縮醛磷脂化合物在制造用于提升縮醛磷脂水平的藥物中的應用。

26、?與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明使用大腸桿菌表達的重組粘細菌carf蛋白在體外純化，來源于粘細菌（ myxococcus?xanthus）的carf膜蛋白能夠利用具有脂肪酸鏈的烷基磷脂酰乙醇胺生成相對應的縮醛磷脂酰乙醇胺，再通過采用胺功能化的化合物4底物和純化的carf膜蛋白合成了化合物5（酰胺縮醛磷脂），該方法能夠彌補縮醛磷化學酶法合成的空缺，且具有簡便可控、高效節(jié)能、環(huán)境友好的優(yōu)勢，合成出縮醛磷脂在神經(jīng)類細胞中有超強清除活性氧能力，可以應用于神經(jīng)性疾病的治療藥物中，通過使降低的縮醛磷脂水平上升來預防或改善由縮醛磷脂的缺乏引起的各種疾病的目的。