本發明涉及細胞生物學，尤其涉及一種雞原代腦微血管內皮細胞提取純化方法。

背景技術：

1、腦微血管內皮細胞（brain?microvascular?endothelial?cells,?bmecs）是血腦屏障（blood-brain?barrier,?bbb）的核心功能單元，在維持中樞神經系統（centralnervous?system,?cns）內環境穩定中發揮著關鍵作用。bmecs體外培養對研究神經退行性疾病、腫瘤轉移、病毒入侵及藥物滲透性具有重要意義。

2、目前，常用的提取方法主要包括機械分離法、酶消化法及磁珠分選法，但仍然存在以下缺陷：（1）純度不足：傳統機械分離法易混入成纖維細胞、神經膠質細胞和周細胞，純度通常低于70%。（2）存活率低：長時間酶消化（如膠原酶單一消化超過30分鐘）導致細胞膜損傷，存活率不足50%。（3）流程繁瑣：現有技術依賴多步離心或抗體分選（如cd31磁珠分選），操作耗時8-10小時且成本高昂。

3、與哺乳動物相比，禽腦部結構更特殊，如大腦皮層不發達、中腦發達、嗅球較小。哺乳動物的bmecs分離培養尚有以上缺陷，那么家禽bmecs的分離培養更是難上加難。鑒于家禽bmecs的分離培養對家禽嗜神經病毒研究及建立動物神經疾病模型具有重要意義，亟需研發高純度、高存活率、成本低的純化方法。

技術實現思路

1、本發明提供了一種雞原代腦微血管內皮細胞提取純化方法，通過雙重酶消化、去髓鞘處理及percoll梯度離心協同優化，分離的細胞純度提升顯著，細胞存活率高，成本低，操作簡化，解決了現有技術中存在的問題。

2、為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案是：

3、一種雞原代腦微血管內皮細胞提取純化方法，包括如下操作步驟：

4、（1）雞胚腦組織獲取與預處理

5、選擇16-19日齡即將出殼的spf雞胚，分開頭部及軀干；分離腦組織，收集除凈腦膜的大腦并清洗，剪成腦組織塊；將腦組織塊轉移至無菌離心管中，加入dmem，用吸管吹打，直至組織渾濁；

6、（2）初次酶消化

7、用初次酶消化液消化步驟（1）處理后的組織塊，混懸液進行磁力攪拌，去除間質蛋白；然后加入一定體積的dmem重懸組織，4℃下，離心1000?g，?10?min，棄去上清；

8、所述初次酶消化液的組成為：膠原酶ⅱ型和dnase?i的混合液；

9、（3）去髓鞘處理

10、用bsa-dmem重懸；4℃下，離心1000?g，20?min，依次棄磷脂上層及bsa；

11、（4）二次酶消化

12、用二次酶消化液消化步驟（3）處理后組織，消化處理后混懸液繼續磁力攪拌30min，釋放內皮細胞；

13、所述二次酶消化液的組成為：accutase細胞消化液和dnase?i的混合液；

14、（5）percoll梯度離心純化

15、在步驟（4）二次酶消化的同時，用水平離心機離心percoll得到percoll梯度離心液體，備用；

16、向步驟（4）二次酶消化結束的細胞中加入10ml?dmem，4℃下，離心1000?g，10?min，棄上清，得沉淀；用2ml?dmem重懸沉淀，然后將細胞溶液緩慢沿管壁移入前述離心好的percoll梯度離心液體，4℃下離心700?g，10?min；獲得的中間層液體為細胞；

17、（6）細胞差速貼壁培養與篩選

18、將步驟（5）分離的內皮細胞直接鋪在包被液處理的細胞培養皿中，37℃，5%?co2靜置45?min后，取細胞液鋪于新孔中，24?h后換為不含嘌呤霉素的培養基繼續培養。

19、進一步地，步驟（1）分離腦組織的操作為：在pbs中分離雞胚頭部的大腦、小腦，用滅菌濾紙將腦膜剝離干凈，收集除凈腦膜的大腦；分離腦組織的清洗采用dmem清洗3次，然后移除dmem，剪碎腦組織至1cm3大小的腦組織塊。

20、進一步地，用吸管吹打時，先用25?ml吸管吹打，再用10?ml吸管吹打。

21、進一步地，步驟（2）初次酶消化液中膠原酶ⅱ型在配置前，采用dmem稀釋至10?mg/ml；dnase?i在配置前，采用pbs稀釋至1?mg/ml；膠原酶ⅱ型和dnase?i體積比為3:1；步驟（2）磁力攪拌條件為37℃，1h；步驟（2）dmem所用體積為10?ml。

22、進一步地，步驟（3）中bsa-dmem為20%?w/v的bsa-dmem。

23、進一步地，步驟（3）bsa-dmem重懸25次。

24、進一步地，步驟（4）二次酶消化液中dnase?i?在配置前，采用pbs稀釋至1?mg/ml；accutase細胞消化液和?dnase?i體積比為100:1；步驟（4）磁力攪拌條件為37℃，30min。

25、進一步地，步驟（5）中percoll梯度離心操作為：在4℃下，3000?rpm離心1h。

26、進一步地，步驟（5）中percoll梯度離心液組成為:?19?ml?1×pbs+1?ml?10×pbs+1?ml?fbs+10?ml?percoll，共31?ml，過濾，4℃保存。

27、進一步的，步驟（6）細胞差速貼壁培養與篩選的具體操作如下：

28、s1將步驟（5）中間層液體與5?ml?dmem混合，4℃下離心1000?g，10?min；得沉淀；

29、s2用含嘌呤霉素的完全培養基重懸s1所得沉淀，每1?cm2面積用200?μl；

30、s3用提前篩選的包被液處理細胞培養皿，將過夜的細胞培養皿包被液吸出，用無菌1×pbs清洗細胞培養皿，洗完直接用；將s2得到的細胞液直接鋪在細胞培養皿中，在37℃，5%?co2靜置45?min；

31、s4取細胞液于新孔中，24h后換為不含嘌呤霉素的培養基繼續培養；

32、s5每2-3天換一次液，直到細胞密度達到90%。

33、進一步地，步驟（6）中s2所述含嘌呤霉素的完全培養基組成為：400?ml?dmemmedium+100?ml?fbs?(20%)+0.25?ml?fgfb?(20?μg/ml;?0.05%)+0.5?ml肝素鈉?(100?μl/ml;?0.1%)+0.5?ml嘌呤霉素(4?mg/ml;?0.1%)。

34、進一步地，步驟（6）中包被液處理的細胞培養皿為重組纖連蛋白包被培養皿。

35、進一步地，所述重組纖連蛋白為fn重組纖連蛋白，濃度0.1?mg/ml。

36、本發明的有益效果：

37、1、本發明提取純化方法從雞胚腦組織中提取并純化雞原代腦微血管內皮細胞高效、成本低，適用于生物醫學研究、藥物篩選及血管相關疾病模型的構建。

38、2、本發明通過雙重酶消化去除間質蛋白及髓鞘脂質，結合percoll梯度分離雜質，雞原代腦微血管內皮細胞（chbmecs）的cd31陽性率≥92%，相比傳統方法一般≤80%，純度提升明顯。通過對存活率優化，具體是使用中性消化酶消化，酶消化時間明顯縮短，并對離心參數進行精準控制，細胞存活率達82%以上。該提取純化方法無需磁珠分選或抗體標記，與哺乳動物分離方法相比，本發明使用一種包被液（重組纖連蛋白），消化液成分簡單，節約試劑成本40%，而哺乳動物的分離方法用的包被液為膠原酶ⅳ和纖連蛋白混合液、消化酶ⅱ為膠原酶/分散酶，該類試劑價格昂貴。此外，相比傳統方法提取純化需要8-10?h，本發明方法總耗時6小時，適合規模化制備。

39、3、本發明方法中消化時間、細胞分離時離心參數及細胞培養條件的控制，有效提升了細胞純度。鑒于目前尚未有針對雞腦微血管內皮細胞分離提取的專用方法，該方法在提高所分離的雞腦微血管內皮細胞純度的基礎上，細胞存活率高，用于實驗研究，具有很好的應用價值。