編碼基因、 Strep-tagll標簽編碼基因、腸激酶識別位點編碼基因、shTRAIL編碼基因和分選信號蛋白 AFVY編碼基因組成；其核苷酸序列為序列9 ;第13-87位為信號肽PR-S編碼基因、第88-111 位為Str印-tagll標簽編碼基因、第112-126位為腸激酶識別位點編碼基因、第127-630位 為shTRAIL編碼基因、第631-642位為分選信號蛋白AFVY編碼基因；
[0113] 融合蛋白shTRAIL-212編碼基因：從5 '端至3'端依次由信號肽PR-S編碼基 因、Str印-tagll標簽編碼基因、腸激酶識別位點編碼基因、shTRAIL編碼基因和分選信號 蛋白KDE編碼基因L組成；其核苷酸序列為序列11，第13-87位為信號肽PR-S、編碼基因 第88-111位為Str印-tagll標簽編碼基因、第112-126位為腸激酶識別位點編碼基因、第 127-630位為shTRAIL編碼基因和第631-642位為分選信號蛋白KDEL編碼基因。
[0114] 實施例2、表達融合蛋白的轉基因植物構建及其功能驗證
[0115] -、表達融合蛋白的轉基因植物構建
[0116] 1、表達融合蛋白的重組載體構建
[0117] 將融合蛋白 shTRAIL-110、 shTRAIL-111、 shTRAIL-112、 shTRAIL-210、 shTRAIL-211、shTRAIL-212編碼基因分別替換入門載體pENTR-P35S::⑶S中Not I和Xma I酶切位點間的DNA片段，得到連接融合蛋白shTRAIL-110編碼基因的入門載體、連接融合 蛋白shTRAIL-111碼基因的入門載體、連接融合蛋白shTRAIL-112碼基因的入門載體、連接 融合蛋白shTRAIL-210碼基因的入門載體、連接融合蛋白shTRAIL-211碼基因的入門載體、 連接融合蛋白shTRAIL-212編碼基因的入門載體；
[0118] 再將連接融合蛋白shTRAIL-110編碼基因的入門載體、連接融合蛋白 shTRAIL-111碼基因的入門載體、連接融合蛋白shTRAIL-112碼基因的入門載體、連接融合 蛋白shTRAIL-210碼基因的入門載體、連接融合蛋白shTRAIL-211碼基因的入門載體、連 接融合蛋白shTRAIL-212編碼基因的入門載體分別通過LR反應與目的載體pEarleyGate 303進行同源重組，得到表達融合蛋白的重組載體pEXPR-P35S: : shTRAIL-110、 PEXPR-P35S: : shTRAIL-111、pEXPR-P35S: : shTRAIL-112、pEXPR-P35S: : shTRAIL-210、 PEXPR-P35S::shTRAIL-211、pEXPR-P35S::shTRAIL-212。
[0119] 2、重組菌的構建
[0120] 將上述各重組載體導入農桿菌GV3101: :pMP90,得到重組農桿菌GV3101: :pMP90/ PEXPR-P35S: : shTRAIL-110、GV3101: :pMP90/pEXPR-P35S: : shTRAIL-111、GV3101: :pMP90/ PEXPR-P35S: : shTRAIL-112、GV3101: :pMP90/pEXPR-P35S: : shTRAIL-210、GV3101: :pMP90/ PEXPR-P35S: : shTRAIL-211、GV3101: :pMP90/pEXPR-P35S: : shTRAIL-212 (提取質粒測序驗 證正確性。）。
[0121] 3、轉基因煙草和轉基因擬南芥的獲得
[0122] A、農桿菌蘸花法進行擬南芥的遺傳轉化
[0123] 1)以轉化的當天為T日。在"T-2"日夜晚，分別挑取重組農桿菌GV3101::pMP90/ PEXPR-P35S: : shTRAIL-110、GV3101: :pMP90/pEXPR-P35S: : shTRAIL-111、GV3101: :pMP90/ PEXPR-P35S: : shTRAIL-112、GV3101: :pMP90/pEXPR-P35S: : shTRAIL-210、GV3101: :pMP90/ PEXPR-P35S: : shTRAIL-211、GV3101: :pMP90/pEXPR-P35S: : shTRAIL-212 單克隆，接種于 lOmL YEB+Rif 50mg/L+Kan 50mg/L+Gent 50mg/L。28°C，220rpm 培養 24h。在 "T-l" 日夜 晚，以1:100的比例擴大培養。
[0124]2)配制浸染液（1L) :MSB5 干粉 2. 2g，蔗糖 50g，6-BA 0? 044 y mol/L，Silwet L-77200yL，pH5. 7〇
[0125] 3) T日中午，待農桿菌0D600 = 1時，停止搖菌。4, OOOrpm離心15min，富集菌體。
[0126] 4)將菌體沉淀用浸染液重新懸浮，調整菌液0D600 = 0. 8-1. 0。
[0127] 5)將野生型擬南芥剪去果莢，將花序浸入浸染液恰好30s。
[0128] 6)將浸染完畢的擬南芥側放在大塑料托盤的底部。避光14h左右后正常培養。
[0129] 得到T。代轉shTRAIL-110擬南芥、T。代轉shTRAIL-111擬南芥、T。代轉 shTRAIL-112擬南芥、T。代轉shTRAIL-210擬南芥、T。代轉shTRAIL-211擬南芥、T。代轉 shTRAIL-212 擬南芥。
[0130] B、農桿菌介導的葉盤法轉化野生型煙草
[0131] 1)無菌苗的獲得：取適量本氏煙草（N. benthamiana)NC89種子于無菌2mL離心管 中，75%乙醇消毒308，10%似(：10消毒30111111，無菌水洗10遍。置于1/21^培養基上，黑暗 下28°C萌發。待萌發后光照培養。
[0132] 2)工程菌的活化：以轉化的當天為"T"日。在"T-2"日夜晚，挑取上述各種重組農 桿菌工程菌單克隆，接種于 10mL YEB+Rif 50mg/L+Kan 50mg/L+Gent 5〇11^/匕28°(^，220印111 培養24h。在"T-l"日夜晚，以1:100的比例擴大培養。至"T"日，0D 6QQ= 0. 4-0. 6時，結 束培養。
[0133] 3)工作菌液的制備：室溫下，1，500g，離心10min富集菌體。棄上清，加入與菌液 等體積的液體MS0培養基，重懸菌體沉淀并調整0D6M= 0. 3~0. 4。
[0134] 4)侵染：將煙草葉片在無菌紙上修剪成IX lcm左右的葉盤，盡量去除較大葉脈， 浸入菌液30min左右。
[0135] 5)共培養：將侵染后的葉盤擺放于MS 1培養基表面，上下各覆蓋一層無菌濾紙。 28°C暗培養3d。
[0136] 6)選擇培養：將共培養后的葉盤置于附加相應選擇壓的MS 2培養基，視生長狀態 一周轉接一次。
[0137] 7)生根培養：待抗性芽長到2-3cm時，切下轉到附加相應選擇壓的MS 3培養基， 誘導生根。
[0138] 8)煉苗、移栽：待幼苗葉片生長至組培瓶的瓶口附近時，開蓋煉苗3d左右，并移栽 至營養土中，進行常規管理。
[0139] 得到 T。代轉 shTRAIL-110 煙草、T。代轉 shTRAIL-111 煙草、T。代轉 shTRAIL-112 煙草、T。代轉 shTRAIL-210 煙草、T。代轉 shTRAIL-211 煙草、T。代轉 shTRAIL-212 煙草。
[0140] C、分子鑒定
[0141] 收取上述T。代轉shTRAIL-110擬南芥、T。代轉shTRAIL-111擬南芥、T。代轉 shTRAIL-112擬南芥、T。代轉shTRAIL-210擬南芥、T。代轉shTRAIL-211擬南芥、T。代轉 shTRAIL-212擬南芥的種子，播種，用Basta篩選得到T1代抗性植株。提取T1代抗性植株 的基因組DNA，用TRAIL引物進行PCR擴增。
[0142] 結果如圖2所示，M :DNA分子量標準；1-9 :擬南芥株系編號；10 :陰性對 照（野生型擬南芥）；pEXPR-P35S: : shTRAIL-110 為 代轉 shTRAIL-110 擬南芥、 PEXPR-P35S: : shTRAIL-111 為 1\代轉 shTRAIL-111 擬南芥、pEXPR-P35S: : shTRAIL-112 為 代轉 shTRAIL-112 擬南芥、pEXPR-P35S: : shTRAIL-210 為 T 轉 shTRAIL-210 擬南芥、 PEXPR-P35S: :shTRAIL-211 為 1\代轉 shTRAIL-211 擬南芥、pEXPR-P35S: :shTRAIL-212 為 代轉shTRAIL-212擬南芥，可以看出，除個別株系表現為Basta抗性的假陽性外，大部 分Basta抗性植株經PCR后，擴增出與預期大小相一致的目的條帶，判定為轉基因陽性株 系，即為陽性代轉shTRAIL-110擬南芥、陽性T i代轉shTRAIL-111擬南芥、陽性T i代轉 shTRAIL-112擬南芥、陽性1\代轉shTRAIL-210擬南芥、陽性T丨代轉shTRAIL-211擬南芥、 陽性代轉shTRAIL-212擬南芥。
[0143] 將上述陽性T1代播種，直到得到1~3代轉shTRAIL-110擬南芥、1~ 3代轉shTRAIL-111 擬南芥、了3代轉shTRAIL-112擬南芥、T 3代轉shTRAIL-210擬南芥、T 3代轉shTRAIL-211擬 南芥、了3代轉shTRAIL-212擬南芥。
[0144] 收取上述T。代轉shTRAIL-110煙草、T。代轉shTRAIL-111煙草、T。代轉 shTRAIL-112 煙草、T。代轉 shTRAIL-210 煙草、T0 代轉 shTRAIL-211 煙草、T0 代轉 shTRAIL-212煙草的種子，播種，用草銨膦篩選得到T1代抗性植株。提取T1代抗性植株的 基因組DNA，用TRAIL引物進行PCR擴增。
[0145] 結果如圖3所示，M :DNA分子量標準；1-9 :煙草株系編號；10 :陰性對照（野生型 煙草）；pEXPR-P35S: :shTRAIL-110 為 1\代轉 shTRAIL-110煙草、pEXPR-P35S: :shTRAIL-lll 為 1\代轉 shTRAIL-111 煙草、pEXPR-P35S: :shTRAIL-112 為 T 轉 shTRAIL-112 煙草、 PEXPR-P35S: :shTRAIL-210 為 1\代轉 shTRAIL-210 煙草、pEXPR-P35S: :shTRAIL-211 為 T i 代轉 shTRAIL-211 煙草、pEXPR-P35S: :shTRAIL-212 為 1\代轉 shTRAIL-212 煙草，除個別 株系表現為Basta抗性的假陽性外，大部分Basta抗性植株經PCR后，擴增出與預期大小相 一致的目的條帶，判定為轉基因陽性株系，即為陽性代轉shTRAIL-110煙草、陽性T i代轉 shTRAIL-111煙草、陽性1\代轉shTRAIL-112煙草、陽性T丨代轉shTRAIL-210煙草、陽性T : 代轉shTRAIL-211煙草、陽性代轉shTRAIL-212煙草。
[0146] D、蛋白水平檢測
[0147]陽性代轉shTRAIL-110煙草、陽性T丨代轉shTRAIL-111煙草的種子用RIPA (強） 試劑提取總蛋白，Western Blot檢測目的蛋白表達，一抗為兔源性shTRAIL多抗（北京 義翹神州生物技術有限公司，10409-MM03-50)，二抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗 (EarthOx, E030120-02)。以原核表達的shTRAIL為陽性對照。