一種用于毛細管電泳的無膠篩分介質及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及毛細管電泳的篩分介質技術領域，具體設及一種用于毛細管電泳的無 膠篩分介質及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 現有技術中，毛細管電泳（capillaryelectrophoresis,CE)又叫高效毛細管電 泳（HPCE)，是近年來發展最快的分析方法之一。1981年化rgenson和Lukacs首先提出在 75μm內徑的毛細管柱內加高電壓進行分離，創立了現代毛細管電泳。1984年Ter油e等建 立了膠束毛細管電動力學色譜。1987年Hjerten建立了毛細管等電聚焦，Cohen和Karger 提出了毛細管凝膠電泳。1988~1989年出現了第一批商品化的毛細管電泳儀。短短幾年 內，由于毛細管電泳（C巧符合W生物工程為代表的生命科學各領域中對多膚、蛋白質（包 括酶、抗體）、核巧酸乃至脫氧核糖核酸值NA)的分離分析要求，從而得到了迅速的發展。
[0003] 毛細管電泳（C巧是一類W毛細管為分離通道，W高壓直流電場為驅動力，W樣品 在電場下移動速率不同而達到分離目的的液相微分離分析技術，具有分離效率高、分析時 間短、樣品消耗少等優點。毛細管電泳通常使用石英毛細管，內徑范圍在50μηι至100μηι， 長度從25cm到75畑1。在DM分離過程中，分離介質起著非常重要的作用，它決定了DM的 遷移特性、分離度、讀出長度、重現性、注入時間、注入壓力W及毛細管壽命等，因此分離介 質的研究是DNA分離與測序工作中最重要的組成部分之一。分離介質可分為凝膠篩分介質 和無膠篩分介質（非交聯的高分子溶液）兩種。1989年首次報道了W水溶性高分子溶液為 介質的毛細管電泳成功地分離了dsDNA，自此高分子溶液取代凝膠而作為DNA分離介質得 到廣泛研究。
[0004] 理想的DNA分離介質應具備：良好的篩分性能；自涂覆能力，W抑制電滲流W及消 除DNA與毛細管管壁之間的吸附作用；良好的溶解能力和高親水性；高分子量、低粘度，W 便于注入和更換介質，利于DNA分析和分離的自動化；在堿性條件下具有良好的化學穩定 性。現已形成W聚丙締酷胺（LPA)和聚二甲基丙締酷胺（PDMA)為主，其他多種高分子聚合 物為輔的無膠篩分體系。 陽0化]STR分型及ssDNA測序分析使用的溶液通常W-定濃度的線性均聚物作為溶質。 親水性聚合物W非共價方式吸附到毛細管內壁，抑制電滲流并能避免DNA與內壁的相互作 用。LPA具有高親水性和優良的DNA分離能力。但是它還有高粘度、在高PH值條件下易于 水解等缺點。我們在聚合丙締酷胺時嚴格控制聚合反應溫度、時間等影響因素，通過控制分 子量從而提高LPA的纏結熱穩定性，發揮其高親水性及良好的篩分能力。
[0006] 中國專利CN102220599B公開了一種聚合物鏈的準互穿聚合物網絡，所述聚合物 鏈包括：
[0007] (a)長鏈線性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）鏈，其粘均分子量在SOOkDa~1200kDa 的范圍；(b)短鏈線性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）鏈，其粘均分子量在20kDa~60kDa的 范圍；和（C)丙締酷胺和N，N-二甲基丙締酷胺的無規共聚物鏈，所述無規共聚物在所述長 鏈線性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）鏈（a)和所述短鏈線性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）鏈 化）的存在下通過將丙締酷胺單體和N，N二甲基丙締酷胺單體進行氧化還原自由基聚合制 備，所述無規共聚物的分子量大小在IMDa~lOMDa的范圍，其中在所述丙締酷胺和N，N-二 甲基丙締酷胺的無視共聚物鏈中，所述單體丙締酷胺和所述單體N，N-二甲基丙締酷胺的 重量比為90 :10~99. 9 :0. 1 ;其中，所述長鏈、短鏈線性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）和所 述丙締酷胺和N，N-二甲基丙締酷胺的無視共聚物鏈彼此纏結、互穿，形成聚合物鏈的準 互穿聚合物網絡，并且其中，所述聚合物鏈的準互穿聚合物網絡無化學交聯，和其中所述無 視共聚（丙締酷胺-N，N-二甲基丙締酷胺）與所述長鏈聚（N，N二甲基丙締酷胺）和所述 短鏈聚（N，N-二甲基丙締酷胺）兩者之和的重量比是50 :50~99 :10。但是，該專利還存 在分辨率低、穩定性差的問題。

【發明內容】

[0008] 為了克服現有技術中的缺陷，本發明提供制備的篩分介質可用于STR分型、ssDNA 測序的毛細管電泳分離，本發明提供一種制備具有高分辨率、高穩定性、低粘度的毛細管電 泳無膠篩分介質及其制備方法。
[0009] 本發明是通過如下技術方案實現的：一種用于毛細管電泳的無膠篩分介質，包括 聚合物單體、溶劑、鏈轉移劑、引發劑和催化劑，所述聚合物單體為丙締酷胺，所述溶劑為去 離子水，所述鏈轉移劑是異丙醇，所述引發劑是過硫酸錠，所述催化劑是N，N，N，N-四甲基 二乙胺，所述丙締酷胺、去離子水、異丙醇、過硫酸錠和N，N，N，N-四甲基二乙胺的配比為 20-30g:180-270ml:5. 24-7. 86ml:1. 0-2. 0ml:1. 0-2. 0ml，得到無膠篩分介質。
[0010] 進一步地，所述丙締酷胺、去離子水、異丙醇、過硫酸錠和N，N，N，N-四甲基二乙胺 的配比為 25g:222ml:6. 55ml:1. 25ml:1. 25ml。
[0011] 進一步地，所述無膠篩分介質是聚丙締酷胺。
[0012] 本發明還提供了一種用于毛細管電泳的無膠篩分介質的制備方法，包括W下步 驟：
[001引步驟1):將聚合物單體、溶劑、鏈轉移劑、引發劑和催化劑混合步驟，選取所述聚 合物單體為丙締酷胺，所述溶劑為去離子水，所述鏈轉移劑是異丙醇，所述引發劑是過硫酸 錠，所述催化劑是N，N，N，N-四甲基二乙胺混合物；
[0014] 按照所述丙締酷胺、去離子水、異丙醇、過硫酸錠和N，N，N，N-四甲基二乙胺的配 比為25g:222ml:6. 55ml:1. 25ml:1. 25ml;在無氧環境下進行聚合反應，得到聚合物；
[0015] 步驟2):對步驟1)得到的所述聚合物經透析步驟、冷凍干燥步驟之后在溶膠緩沖 液中進行溶脹步驟；
[0016] 步驟3):再經抽濾步驟獲得所述篩分介質，所述抽濾步驟是將溶脹后的溶液經 0. 2μπι的尼龍濾器過濾，所述篩分介質是聚丙締酷胺。
[0017] 進一步地，步驟1)中所述無氧環境是在反應容器中通入高純氮氣條件，反應時間 為10-60分鐘，聚合反應溫度為35 °C。
[0018] 進一步地，所述反應時間為90分鐘。
[0019] 進一步地，所述溶膠緩沖液為濃度配比是：0. 5M:0. 5M:0. 02M:7M的Ξ徑甲基氨基 甲燒、Ν-Ξ(徑甲基）甲基-3-氨基丙橫酸、乙二胺四乙酸巧離絡合劑和尿素溶液。
[0020] 進一步地，步驟2)中所述透析步驟選用截留分子量為12-14邸a的透析袋進行透 析。
[0021] 進一步地，所述聚丙締酷胺重均分子量范圍為10-100邸曰。
[0022] 進一步地，所述聚丙締酷胺重均分子量為20-40邸曰。
[0023]與現有技術相比，優越效果在于：本發明制備的篩分介質具有良好的篩分性能，具 有良好的溶解能力和高親水性，能夠有效的減少DNA與毛細管管壁之間的吸附作用，高分 子量、低粘度，便于注入和更換介質，利于DNA分析和分離的自動化，完全滿足現階段法醫 STR分析檢測的目的要求。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明所述用于毛細管電泳的無膠篩分介質的iH-NMR譜圖，其中溶劑為 〇2〇 ；
[0025] 圖2為本發明所述用于毛細管電泳的無膠篩分介質的LI巧00電泳結果圖譜；
[0026] 圖3為本發明所述用于毛細管電泳的無膠篩分介質的Ladder電泳結果圖譜；
[0027] 圖4為本發明所述用于毛細管電泳的無膠篩分介質的9947A電泳結果圖譜。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合附圖對本發明【具體實施方式】作進一步詳細說明。 陽〇29] 實施例1
[0030] 具體說明本發明提供的一種用于毛細管電泳的無膠篩分介質，包括聚合物單體、 溶劑、鏈轉移劑、引發劑和催化劑，所述聚合物單體為丙締酷胺，所述溶劑為去離子水，所 述鏈轉移劑是異丙醇，所述引發劑是過硫酸錠（APS)，所述催化劑是N，N，N，N-四甲基二乙 胺燈EM邸），所述丙締酷胺、去離子水、異丙醇、過硫酸錠（AP巧和N，N，N，N-四甲基二乙胺 燈EMED)的配比為（20-30)g: (180-270)ml: (5. 24-7. 86)ml: (1. 0-2. 0)ml: (1. 0-2. 0)ml， 得到無膠篩分介質，所述丙締酷胺、去離子水、異丙醇、過硫酸錠（AP巧和N，N，N，N-四甲基 二乙胺燈EMED)的配比為25g:222ml:6. 55ml:1. 25ml:1. 25ml，優選。所述無膠篩分介質是 聚丙締酷胺（LPA)，結構式如下：
[0031]
[0032] 本發明還提供了一種用于毛細管電泳的無膠篩分介質的制備方法，所述方法包括 W下步驟：
[003引步驟1):將聚合物單體、溶劑、鏈轉移劑、引發劑和催化劑混合步驟，選取所述聚 合物單體為丙締酷胺，所述溶劑為去離子水，所述鏈轉移劑是異丙醇，所述引發劑是過硫酸 錠（APS)，所述催化劑是N，N，N，N-四甲基二乙胺燈EMED);
[0034] 按照所述丙締酷胺、去離子水、異丙醇、過硫酸錠（AP巧和N，N，N，N-四甲基二乙胺 燈EMED)的配比為（20-30)g: (180-270)ml: (5. 24-7. 86)ml: (1. 0-2. 0)ml: (1. 0-2. 0)ml; 在無氧環境下進行聚合反應，得到聚合物；
[0035] 步驟2):對步驟1)得到的所述聚合物經透析步驟、冷凍干燥步驟之后在溶膠緩沖 液中進行溶脹步驟；
[0036] 步驟扣：經抽濾后獲得所述篩分介質，所述抽濾是將溶脹后的溶液經0.2μm的尼 龍濾器過濾，所述篩分介質是聚丙締酷胺（L