專利名稱：血管緊張素i轉化酶抑制物質的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能夠降低血壓的血管緊張素I轉化酶(下文縮寫為ACE)抑制物質，更具體地說，涉及通過用蛋白酶分解裙帶菜(裙帶菜屬羽狀物，褐藻科)得到的對ACE具有強抑制活性的肽。
背景技術：
高血壓是動脈硬化、高脂血癥、糖尿病和肥胖的誘因之一。在日本，被診斷為高血壓的人群估計有2000萬或更多，而潛在的高血壓人數也達到很高的數目。最近這些年，盡管對高血壓的診斷標準變得更嚴格，但高血壓仍被認為是無聲殺手。如果聽之任之，高血壓雖無癥狀，但卻常常致死，因此它被認為是和生活習慣緊密相連的疾病之一。為了改善高血壓狀況，很多研究機構積極進行了降血壓藥物和調節(jié)血壓的食物成份的開發(fā)。
在有機體內，腎素-血管緊張素系統(tǒng)是靠電解質來調節(jié)血壓和體內水平衡的一個重要因素。腎素由腎臟的近球細胞分泌到循環(huán)血液中，作用于血管緊張素原，使之轉變?yōu)檠芫o張素I，血管緊張素原在肝臟中合成，存在于血液中。血管緊張素I在血管的內皮細胞中受ACE作用轉變?yōu)檠芫o張素II。血管緊張素II有三個主要生理作用；①可使血管平滑肌強烈收縮，升高血壓，②促進醛固酮從腎上腺皮質分泌到血液，③作用于腎臟近端小管，加強鈉離子在腎小球濾過時的重吸收。所有這些作用都可導致血壓升高。此外，ACE可分解緩激肽并使之失活，而后者具有擴張血管平滑肌的作用。正如所述，ACE同時具有激活腎素--血管緊張素系統(tǒng)(升高血壓系統(tǒng))，但使激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(降低血壓系統(tǒng))失活的功能，因而表現為升高血壓的作用。因此，抑制ACE活性的物質可以抑制血壓的升高，由此考慮開發(fā)含有該抑制物質的藥物和食物。
以食物為原材料且具有ACE強抑制活性的物質，已知有效的物質是通過某種類型的蛋白酶分解動物和植物蛋白得到的肽。由蛋白酶產生的具有ACE強抑制活性的物質，已公開了用動物和植物做原材料的如金槍魚(專利公開號2049147)、無花果樹汁(專利公開號2794094)、南極洲磷蝦(專利公開號2088612)、大豆蛋白(專利公開號1976328)、沙丁魚(專利公開號2086032)、酪蛋白(專利公開號1814531)、干的狐鰹(日本第69397/1992號發(fā)明專利公開公報)、谷蛋白(日本第66594/1992號發(fā)明專利公開公報)和大米蛋白(日本第279529/1992號發(fā)明專利公開公報)。但是，在這些物質中，已投入實際應用的很少。由于一些原因，如效果不佳、味道和氣味及類似原因，使之很難用作食物。此外，已公開了一些以海藻如紫菜(專利公開號2678180)和羊棲菜(日本第36391/1998號發(fā)明專利公開公報)作為原材料的例子，而且有申請者也證實了水解裙帶菜得到的四種四肽具有ACE抑制效果(專利申請第284647/1999號)。此外，也公開了含有海藻酶解產物的健康食品(日本第289202/1995號發(fā)明專利公開公報)。這些發(fā)明以紫菜、羊棲菜和裙帶菜作為原材料、在所有情況中都以胃蛋白酶作為蛋白水解酶來獲得具有ACE強抑制效果的肽。
從科學和醫(yī)藥的角度看，鑒定出生理活性物質并在分離及純化后使用是很重要的，但是，考慮到用作食物，從經濟等角度看，在分離及純化后使用它們在工業(yè)生產上并不實用。當用作一食物成份時，在很多情況下用粗提或經略微純化的蛋白分解產物是實際可行的。此外，用胃蛋白酶作為蛋白水解酶水解蛋白得到的產物具有不良的味道，因此用該酶得到粗提或經略微純化的成份用于降低血壓在實際應用上是行不通的。
此外，在日本第289202/1995號發(fā)明專利公開公報中，公開了用alkalase來水解海帶(海帶屬)得到肽的方法，但在該專利中對血壓沒有描述。
日本社會的高度老齡化、人口及醫(yī)療費用的增加已成為一個嚴重的問題。此外，盡管平均壽命延長了，但由于臥床不起和癡呆的日益增加，老年人不能安度健康的社會生活成為另一問題。從改善這些問題的角度出發(fā)，以日常飲食來保持和促進健康的想法是有遠見的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是通過以日常攝入的裙帶菜作為原材料，用蛋白酶分解裙帶菜蛋白產生一具有ACE強抑制活性的肽，然后用這些處理產物作為原材料，提供一種具有降低血壓活性的安全食物組份。
考慮到該目的，發(fā)明者發(fā)現，當用各種蛋白酶分解處理裙帶菜時，由桿菌產生的內切蛋白酶可產生具有強ACE抑制活性的肽，從而使本發(fā)明得以完成。
本發(fā)明使用的蛋白酶為內切酶。由外切酶水解產生的分解產物僅表現出弱的ACE抑制活性。
作為桿菌產生的內切蛋白酶，優(yōu)選使用枯草芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌產生的酶。當用這些蛋白水解酶分解處理裙帶菜時，可以產生一些強的ACE抑制活性肽，當用其它公知的蛋白酶如木瓜蛋白酶、blomelain、胰酶制劑、曲霉屬酶和根霉菌屬酶時，不能獲得本發(fā)明中那些強的ACE抑制活性肽。
盡管日本第284647/1999號發(fā)明專利公開公報中描述的胃蛋白酶分解產物的ACE抑制活性正好落入本發(fā)明的范圍之內，但同本發(fā)明中描述的酶相比，其作用程度比較弱，此外，用胃蛋白酶消化裙帶菜得到的肽產物具有苦味。
此外，即使根據本發(fā)明使用該酶，當使用的海藻原材料不同時，不能獲得在用裙帶菜時得到的強的ACE抑制活性，在有些情況下，根本不能獲得ACE抑制活性。也就是說，對于本發(fā)明的酶，可以說裙帶菜蛋白是產生ACE抑制活性物質的優(yōu)選底物。
當用本發(fā)明的胃蛋白酶分解裙帶菜時，從縮短反應時間和酶的穩(wěn)定性方面考慮，優(yōu)選在酶的最適宜溫度和pH值的條件下進行，但是，如果在常規(guī)范圍條件下，也能達到目標。此外，即使用枯草芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌產生的酶順序作用，也可以獲得具有ACE強抑制活性的肽。
就裙帶菜作為原材料來說，裙帶菜的葉、莖和孢子葉的所有部分都可使用。此外，就裙帶菜的葉來說，任何干的裙帶菜、煮的、鹽腌的裙帶菜和原始裙帶菜都可使用，無論葉的厚度、顏色或產地。也就是說，無論原材料裙帶菜的產地和形狀怎樣，都可以獲得具有相同ACE抑制活性效果的肽。
此外，為了簡化生產過程，提高裙帶菜中蛋白轉化的效率，優(yōu)選在該過程的第一步用藻酸裂解酶去除藻酸，可促進裙帶菜肽的獲得。一般來說，當裙帶菜在pH值大于4的水溶液中時，其中的藻酸溶出，導致溶液的粘度很高。這樣高粘度的溶液難于攪拌、分離成固相/液相和超濾。通過用藻酸裂解酶預處理，藻酸降解為低分子量的糖類。在此情況下，溶液粘度降低，使溶液的可操作性得到改善。即使使用了藻酸裂解酶，對ACE的抑制活性仍沒有影響。
因為本發(fā)明得到的肽很少有令人不愉快的特異味道和氣味，因此優(yōu)選通過口服攝入。劑量大小依賴于年齡和血壓狀況，但通常為一次10-2000mg，每天一到三次。
本發(fā)明得到的裙帶菜肽可以單獨服用，或同合適的賦形劑等混合，制成粉狀、粒狀、片狀、膠囊等，以方便給藥。此外，也可以同各種食物如糖果、果凍、片狀蛋糕、飲料、湯、面條、米餅、日本蛋糕、冷蛋糕和烤面包混合攝入。
具體實施例方式
以下根據實施例對本發(fā)明進行詳細描述。
實施例1片狀的干裙帶菜用超級離心粉碎器制成直徑為0.2mm或更小的顆粒，將900g的粉狀物懸浮并分散于18kg水中。然后加入0.09g藻酸裂解酶(來自Nagase Biochemical Industries公司)，得到的混合物在45℃處理18小時。得到的產物以5000rpm離心5分鐘。沉淀用水洗滌、干燥，然后粉碎成用于蛋白酶處理的樣品。
將懸浮并分散有1g得到的樣品的25ml水在加入10mg每種蛋白酶后，在一固定的溫度和pH值條件下用酶分解處理18小時。可以用氫氧化鈉和鹽酸調節(jié)pH值。在酶分解處理后，產物在100℃煮沸15分鐘，使酶失活。以100000rpm離心10分鐘去除沉淀，得到上清液。對上清液超濾(Ultra Free-MC，來自Millipore公司，分離分子量10000)，然后檢測ACE抑制活性。
ACE抑制活性用下述方法測定。
底物溶液12.5mM馬尿酰-L-組氨酰-L-亮氨酸(來自Sigma公司)25mg的馬尿酰-L-組氨酰-L-亮氨酸溶解在4.6ml的pH值為8.3的硼酸緩沖液中；ACE溶液250mU/ml ACE(來自Sigma公司)0.25U的ACE溶解在1ml的pH值為8.3的硼酸緩沖液中。
在一試管中加入35μl經超濾的蛋白酶處理的溶液、100μl底物溶液和35μl血管緊張素轉化酶溶液，在37℃反應1小時。然后加入125μl 0.5N的鹽酸停止反應，加入2ml乙酸乙酯，劇烈搖動。溶液以2500rpm離心10分鐘，收集1.5ml的乙酸乙酯層樣品。減壓去除乙酸乙酯層中的乙酶乙酯，并以氮氣填充，加入700μl 1M的氯化鈉溶液，用228nm處的吸光度來測定萃出的馬尿酸的量，獲得酶活值。ACE抑制活性根據下述公式計算ACE抑制活性(％)＝(A-B)/A×100A不含ACE抑制劑時的吸光度B含ACE抑制劑時的吸光度ACE抑制活性含量表示為在這些條件下抑制ACE活性50％時所需的量(IC50)。
表1顯示了用于測試的18種酶及其來源，表2顯示了酶處理時的條件(溫度和pH值)和ACE抑制活性(％)。
此外，對于表現為ACE有效抑制活性的蛋白酶S“Amano”、蛋白酶N“Amano”和Proleather FG-F，分別進行了先蛋白酶S“Amano”后Proleather FG-F(樣品編號20)和先蛋白酶S“Amano”后蛋白酶N“Amano”(樣品編號21)兩個雙階段反應。
表1用于實施例1的蛋白酶

表2實施例1中的測試條件和對血管緊張素轉化酶抑制活性的結果

實施例2將2g片狀干裙帶菜加入100ml水中使之膨脹，用水洗滌。然后，加入100ml水和20mg蛋白酶，混合物在固定的溫度和pH值條件下酶解處理18小時。可以用氫氧化鈉和鹽酸調節(jié)pH值。
在酶分解處理后，產物在100℃煮沸15分鐘，使酶失活。冷卻處理后，以20000rpm離心10分鐘去除沉淀，得到上清液。在上清液中加入水使體積精確到150ml。對部分上清液超濾(UltraFree-MC，來自Millpore公司，分離分子量10000)獲得濾液。對濾液進行適當稀釋，然后檢測ACE抑制活性，獲得IC50值。用于檢測的蛋白酶、水解條件和結果顯示于表3。表3實施例2中的蛋白酶和對血管緊張素轉化酶的抑制活性

實施例3200g煮沸或鹽腌的裙帶菜加3000ml水和3mg藻酸裂解酶，得到的混合物在45℃處理18小時。反應后，得到的產物以5000rpm離心5分鐘。沉淀用水洗滌、干燥，然后粉碎得到樣品。每1g該樣品的處理同實施例1類似，使用表3所顯示4種蛋白酶的每種10mg來測定ACE抑制活性。
各個抑制活性(％)為蛋白酶S“Amano”89％；Proleather FG-F84％；蛋白酶N“Amano”75％；和胃蛋白酶72％，所得結果和實施例1中使用干裙帶菜相同。
用Proleather FG-F、蛋白酶S“Amano”和胃蛋白酶獲得的裙帶菜肽通過單一口服(通過胃探針強迫給藥)對11周齡(每組3只，收縮壓大于等于180mmHg)自發(fā)性高血壓雄性大鼠(SHR)給藥，劑量為100mg/kg，在給藥后3、6、9和24小時后測定血壓。起始時及在給藥后6和24小時的血壓顯示于表4。
表4實施例3的結果

注-1)對照組大鼠數目＝6注-2)在“給藥后6小時”欄中的括號表示在口服給藥6小時后收縮壓的變化。
對比實施例用海帶粉末(海帶屬，褐藻科)代替實施例2中的片狀干裙帶菜，使用相似的處理方法。在所有用蛋白酶處理的產物中，均沒有觀察到對血管緊張素轉化酶的抑制活性。
根據本發(fā)明，通過使用來自桿菌的內切蛋白酶分解裙帶菜得到的裙帶菜肽，可以獲得高度安全的能降血壓的食物。
權利要求
1.一種血管緊張素I轉化酶抑制物質，其含有除胃蛋白酶外其它蛋白酶分解裙帶菜獲得的肽。
2.如權利要求1的血管緊張素I轉化酶抑制物質，其中蛋白酶為來自桿菌的內切蛋白酶。
3.一種具有降血壓活性的蛋白分解產物，其特征為，含有一具有強的血管緊張素I轉化酶抑制活性的肽，該肽是通過除胃蛋白酶外其它蛋白酶分解裙帶菜獲得的。
4.利用權利要求3所限定的蛋白分解產物作為基礎材料的食物組份。
5.一種制備血管緊張素I轉化酶抑制物質的方法，其特征為，通過除胃蛋白酶外其它蛋白酶分解裙帶菜，獲得一具有強的血管緊張素I轉化酶抑制活性的肽。
6.如權利要求5所限定的制備血管緊張素I轉化酶抑制物質的方法，其中裙帶菜用藻酸裂解酶預處理，除去裙帶菜中所含藻酸，經此預處理的裙帶菜通過除胃蛋白酶外其它蛋白酶分解，獲得一具有強的血管緊張素I轉化酶抑制活性的肽。
全文摘要
本發(fā)明的目的是通過以日常攝入的裙帶菜作為原材料,用蛋白酶分解裙帶菜所含的蛋白產生一具有血管緊張素I轉化酶(ACE)強抑制活性的肽,然后用這些處理產物作為原材料,提供一種具有降低血壓活性的安全食物組份。發(fā)明者發(fā)現,當用各種蛋白酶分解處理裙帶菜時,由桿菌產生的內切蛋白酶可產生具有強ACE抑制活性的肽,從而使本發(fā)明得以完成。
文檔編號A61K38/00GK1351174SQ0113420
公開日2002年5月29日 申請日期2001年10月26日 優(yōu)先權日2000年10月27日
發(fā)明者佐藤實, 大場隆, 小林曉生, 船山桂, 加原卓, 仲野隆久 申請人:理研維他命株式會社